Sterile Gewebeentnahme

Quelle: Kay Stewart, RVT, RLATG, Anus; Valerie A. Schroeder, RVT, RLATG. University of Notre Dame, IN

Im Jahr 1959 wurden die 3 R von W.M.S. Russell und r.l. Burch eingeführt, in ihrem Buch den Grundsätzen der humanen experimentelle Technik. Die 3 Rs sind Ersatz, Reduktion und Verfeinerung des Einsatzes von Tieren in der Forschung. ¹ die Verwendung von Zelllinien und Gewebekulturen, die ihren von Versuchstieren Ursprung ist eine Ersatz-Technik, da es für viele Experimente durchgeführt werden kann in-vitro-. Ernte, Gewebe und Organe für den Einsatz in Zell- und Gewebekulturen erfordert aseptischen Technik zur Vermeidung von Kontaminationen des Gewebes. Sterile Ernte ist auch notwendig für Proteine und RNA Analyse und metabolic profiling von Gewebe. Dieses Manuskript wird den Prozess der sterilen Orgel Ernte bei Ratten und Mäusen diskutieren.

Aseptischer Technik muss befolgt werden, um die Sterilität des Gewebes zu gewährleisten. Die Ernte erfolgt in einer Laminar-Flow-Kapuze, die mit Alkohol desinfiziert wurde. Alle verwendete Materialien müssen sterilisiert werden. Der Techniker, die Durchführung der Ernteguts muss persönliche Schutzausrüstungen, einschließlich einer Maske, bouffant, sterile OP-Kittel und sterile OP-Handschuhe don. Das Kleid muss die Handgelenke um zu verhindern, das Vergießen der Hautzellen in der geöffneten Körperhöhle, Petrischalen oder steriles Medium abdecken. Aufrechterhaltung der Sterilität des Technikers erfordert dieses Verfahren, dass ein zweiter, unsterilen Techniker den sterilen Techniker mit der Euthanasie der Tiere unterstützt.

In Experimenten, die die Stoffwechselprofile von Geweben erfordern, hat die Methode der Gewebe Ernte einen großen Einfluss auf die Qualität der erhobenen Daten. ² beide der Euthanasie Verfahren und die Länge der Zeit die Ernte findet können Auswirkungen auf die Integrität des Gewebes. Hypoxie, eine Folge der Euthanasie mit Kohlendioxid, hat nachweislich eine tiefgreifende Wirkung auf die Metaboliten in Geweben. Blutungen der Schiffe im Lungengewebe wird auch durch den Einsatz von Kohlendioxid für Euthanasie verursacht. Die Reihenfolge der Gewebeentnahme beim sequentiellen Dissektion der gezielten Gewebe durchgeführt wird kann Stoffwechselveränderungen, verursachen, da das Gewebe, Alter beginnen oder während der Ernte zerfallen.

Während sterilste ernten eine einzelne Organ Ziel, kann es vorkommen, dass mehr als ein Organ benötigt wird. Während sequenzielle Dissektion werden das Gewebe erforderlich die Reihenfolge diktieren, in der sie sollten entfernt werden. ² Gewebe, die sich rasch verschlechtern müssen so schnell wie möglich folgende Euthanasie geerntet werden. Aufrechterhaltung der Sterilität der Instrumente Organe aus der Bauchhöhle geerntet werden entfernt, in der folgenden Reihenfolge: Milz, Leber, Niere, Nebennieren, Eierstöcke oder Hoden, Zubehör Geschlechtsorgane (Prostata, Samenblasen, Gebärmutter, Eileiter), Bauchspeicheldrüsen-Gewebe, Lymphknoten, Harnblase und Darm-Traktes (Magen, dünn- und Dickdarm). Die Reihenfolge der Orgel Ernte aus der Brusthöhle ist zuerst das Herz und die Lunge, gefolgt von der Sammlung des Thymus, Lymphknoten und Speiseröhre entfernen. ³ neue Handschuhe sind für jede Maus erforderlich.

Einige der sterilen geernteten Organe müssen bewahrt werden. Erhaltung der Gewebe wird durch Blitz Einfrieren mit flüssigem Stickstoff (LN₂) oder mit einer Kombination von LN₂ und 2-Methylbutane erreicht. Für LN₂ allein sind das Gewebe in sterilen Kochsalzlösung gespült, getupft auf einem sterilen saugfähigen Tuch, überschüssige Feuchtigkeit zum Abbau in sterile Aluminium Folie Quadrate gelegt und sofort in der LN₂eingetaucht. ² Bei immunologischen Proben wird 2-Methylbutane hinzugefügt. Das Gewebe ist tatsächlich in der 2-Methylbutane getaucht, die vom LN₂abgekühlt ist. Wenn das Gewebe weiß gedreht haben, sind sie aus der 2-Methylbutane entfernt, in sterilen Packungen platziert und dann direkt in den LN₂platziert.

1. Vorbereitung

1. Häufig verwendete Materialien umfassen 70 % Alkohol in eine Spritzflasche, sterile 20-25 g-Nadeln, zwei Packungen mit sterilen Instrumenten der Iris-Schere und Daumen Zange (eine für die Haut) und eine für den inneren Geweben, Papierhandtücher, sterile Chirurgen Handschuhe, sterile petri Gericht, steriles Medium und sterile Kochsalzlösung.
2. Die Haube-Fan sollte für mindestens 15 Minuten vor dem Eingriff ausgeführt werden, und es sollte mit 70 % Alkohol desinfiziert werden.
3. Wenn die Haube mit einer UV-Lampe Sterilisation ausgestattet ist, kann es verwendet werden, weiter die Arbeitsfläche desinfizieren.
4. Saubere Handschuhe sind für den Aufbau der Haube getragen. Das Gerät wird in der Haube in der Reihenfolge geladen in dem sie, in der Regel von links nach rechts verwendet werden. Dies ermöglicht die Arbeit in einem unidirektionalen Workflow, verhindern, dass schmutzige Gegenstände verunreinigen saubere Elemente durchgeführt werden. Dieses schützt die geernteten Geweben oder Organen vor unbeabsichtigten Kontamination aus der Tierkadaver.
5. Die sterilen Instrument-Packs sind geöffnet, unter Beachtung den sterilen Innenraum der Pakete. Um Sterilität zu gewährleisten, wird das Pack in die Mitte des Tisches gelegt, und jede Klappe ohne Kreuzung über den sterilen Bereich oder der Innenseite der Packung geöffnet. Die unsterilen Person eröffnet die erste obere Klappe indem reflektiert es Weg für ihn / sie. Die seitlichen Klappen werden dann mit beide Hände-One auf jede Klappe geöffnet- und ziehen sie aus der Packung. Die letzte Klappe wird dann in Richtung der Person Öffnen der Packs, kümmert sich um zu vermeiden, berühren eines der inneren Oberflächen der Packung gezogen.
6. Legen Sie die Papiertücher in der Haube, und befeuchten Sie sie mit Alkohol.
7. Die unsterilen Person werden die Tiere einschläfern.
8. Die sterile Person trägt zwei Sätze von sterilen OP-Handschuhe.
9. Die unsterilen Person legt den Kadaver auf die Papiertücher und völlig saugt die Karkasse mit 70 % Alkohol.
10. Mit einem Satz von sterile Schere und Pinzette, machen Sie einen horizontalen Schnitt in der Haut nur anterior der Vorhaut (bei Männern) oder des Beckenknochens (bei Frauen). Durchtrennung der Bauchmuskulatur zu vermeiden.
11. Die Instrumente beiseite.

(2) Ernte Gewebe

1. Machen Sie einen kleinen Schnitt nur anterior das Becken bei Frauen und über die Vorhaut bei Männern.
2. Legen Sie den Daumen unter dem Schnitt und erfassen Sie der kranialen Rand des Schnittes zu. Mit der anderen Hand sicher halten Sie den hinteren Gliedmaßen und Rute und ziehen Sie die Haut in Richtung zum Kopf.
3. Die Haut wird von den Körper oberhalb der hinteren Gliedmaßen losreißen und kann über den Kopf und Vorderbeine innen nach außen gedreht werden. Dies entfernt effektiv Haar Verunreinigungen während der Orgel Ernte.
4. Genießen Sie den Körper wieder mit 70 % Alkohol, und entfernen Sie der oberflächlichen Paar Handschuhe, die nicht mehr steril sind.
5. Öffnen Sie die Bauchhöhle mit sterilen Instrumenten.
   1. Milz
      1. Um die Milz zu ernten, ist der Körper im rechten seitlichen liegen aufgestellt.
      2. Die Milz kann durch die Bauchmuskulatur visualisiert werden.
      3. Ein Scherenschnitt erfolgt direkt über die Milz.
      4. Die Milz ist sanft aus der Körperhöhle eingefahren.
      5. Wenn alle Anlagen zwischen Milz, Magen und Bauchspeicheldrüsen-Gewebe zu schneiden, zu vermeiden Punktierung oder reißen die Orgel.
   2. Leber
      1. Um andere Bauchorgane zu ernten, steht der Körper dorsal liegen.
      2. Die Bauchmuskulatur ist gehoben und wegschneiden, eine ovale Öffnung direkt über die Bauchhöhle verlassen.
      3. Nach Freilegung der Bauchhöhle, spiegeln Sie die Leber kaudal von der Membran.
      4. Trennen Sie sorgfältig jede Befestigung der Leberzellkrebs an der Membran Membranen.
      5. Machen Sie einen Schnitt senkrecht auf die Wirbelsäule durch die Blutgefäße sichtbar zwischen der Leber und des Zwerchfells.
      6. Heben Sie die Leber und reflektieren Sie es gegen das Zwerchfell, die Anlagen unter ihm zu visualisieren.
      7. Es werden dünne Membranen anbringen die kleinere Lappen der Leber, Magen und Dünndarm, die unterbrochen werden müssen.
      8. Fassen Sie die fibrösen Knoten in der Mitte der Leber an seiner Unterseite, und heben Sie die Orgel um die Anlagen zu finden. Trennen Sie die Leber von der zugrunde liegenden Organen und Geweben.
      9. Beachten Sie, dass die Leber empfindlich ist und leicht durchstoßen werden kann, wodurch die Freisetzung von Blut; Daher müssen sie sorgfältig behandelt werden.
   3. Nieren
      1. Schieben Sie nach Freilegung der Bauchhöhle den Darm auf der linken Seite die rechte Niere zu visualisieren, oder nach rechts, um die linke Niere zu visualisieren.
      2. Um die Niere zu entfernen, verwenden Sie Zange Sägeblätter, um unterhalb der Niere, die Orgel aus dem Körper zu isolieren zu erfassen. Schneiden Sie mit einer Schere oder einem Skalpellklinge, die Niere vom Körper weg. Machen Sie den Schnitt unter der Zange zur Vermeidung von Schäden der Niere.
      3. Sobald die Niere entfernt wird, kann Fett aus der Orgel getrimmt werden.
   4. Eierstock
      1. Bewegen Sie nach Freilegung der Bauchhöhle den Darm cranially, die Gebärmutter zu visualisieren.
      2. Folgen Sie links und dann rechts, Hörner der Gebärmutter zu den Eierstöcken.
      3. Die Eierstöcke sind klein. Bei älteren Tieren können sie in Fett eingebettet sein.
      4. Schieben Sie die Zange unter der Fruchtknoten, aus dem Körper zu isolieren, und schneiden Sie es frei von Fett und die Eileiter.
   5. Hoden
      1. Nach der Eröffnung der Bauchhöhle, sanft inguinalen Fettpolster und herausziehen Sie es anterior.
      2. Dies zieht die Hoden aus dem Hodensack.
      3. Sobald die Hoden ausgesetzt ist, schneiden Sie die Anlagen auf dem Hodensack und der Samenleiter aus dem Körper zu befreien.
      4. Dies geschieht für jeden Hoden.
6. Der Brusthöhle wird geöffnet, um die thorakalen Organe entfernen
   1. Der Körper befindet sich im dorsalen liegen. Es ist unerlässlich, dass die Haut auch über dem Kopf niederschlagen, wenn Organe der Brusthöhle geerntet werden.
   2. Fassen Sie das Xiphoid Prozeß und Aufzug ermöglichen einen Schnitt durch die Bauchmuskulatur nur kaudalen an den Rippen. Erweitern Sie den Schnitt entlang der unteren Kurve des Brustkorbes auf beiden Seiten. Dies ermöglicht die Visualisierung der Membran.
   3. Punktion der Membran durch ein kleines in den Brustkorb an den seitlichen Punkt schneiden Sie auf jeder Seite möglich machen. Schneiden Sie die Membran von den Rippen.
   4. Heben Sie die Rippen am Xiphoid der thorakalen Organe zu visualisieren.
   5. Den seitliche Schnitt an die Spitze des Brustbeins auf beiden Seiten zu erweitern, und öffne die Truhe.
   6. Herz und Lunge werden am leichtesten zusammen entfernt.
      1. Legen Sie die Zange senkrecht zur Trachea, und fassen Sie die Luftröhre fest.
      2. Mit der Schere, machen Sie einen Schnitt senkrecht zur Trachea nur anterior der Zange. Dieser Schnitt sollte die Luftröhre und die Speiseröhre trennen.
      3. Ohne den Griff auf die Luftröhre lösen, heben Sie die Luftröhre bis kaudal.

Obwohl viele der Verfahren für sterile Orgel Ernte ein standard Autopsie ähneln, ist der Einsatz von steriler Technik unabdingbar für Gewebe mit Wert für experimentelle Verfahren, darunter Ernte Zellen aus dem ausgeschnittenen Gewebe. Profilerstellung oder das Sammeln von RNA aus Gewebe kann beeinträchtigt werden, wenn Sterilität nicht gepflegt ist.

1. Russel, W.M.S. and Burch, R.L. 1959. The Principles of Humane Experimental Technique. Methuen: London.
2. Petucci, C., Rojas-Betancourt, S., and Gardell, S.J. 2012. Comparison of tissue harvest protocols for the quantitation of acylcarnitines in mouse heart and liver by mass spectrometry. Metabolomics. 8.784-792.
3. Parkinson, C.M., O'Brien, A., Albers, T.M., Simon, M.A., Clifford, C.B., and Pritchett-Corning, K.R. 2011. Diagnostic Necropsy and Selected Tissue and Sample Collection in Rats and Mice. 54. e2966. 1-7.