Herstellung und Aufreinigung von Suspensionskulturen von Adeno-assoziierten Viren durch Iodixanol-Dichtegradientenzentrifugation für In-vivo-Anwendungen

Adeno-assoziiertes Virus wird in Suspensionszellkultur hergestellt und durch doppelte Iodixanol-Dichtegradientenzentrifugation gereinigt. Es sind Schritte enthalten, um die Gesamtvirusausbeute zu erhöhen, das Risiko von Virusausfällungen zu verringern und das endgültige Virusprodukt weiter zu konzentrieren. Die erwarteten Endtiter erreichen 10^{bis 12} Viruspartikel/ml und sind für die präklinische In-vivo-Anwendung geeignet.

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung und Aufreinigung rekombinanter Adeno-assoziierter Viren (rAAV) durch Iodixanol-Dichtegradientenzentrifugation, eine serotypagnostische Methode zur Aufreinigung von AAV, die erstmals 1999 beschrieben wurde. rAAV-Vektoren werden häufig in Gentherapieanwendungen verwendet, um Transgene an verschiedene menschliche Zelltypen zu liefern. In dieser Arbeit wird das rekombinante Virus durch Transfektion von Expi293-Zellen in Suspensionskultur mit Plasmiden hergestellt, die für das Transgen, das Vektorkapsid und die adenoviralen Helfergene kodieren. Die Iodixanol-Dichtegradientenzentrifugation reinigt vollständige AAV-Partikel basierend auf der Partikeldichte. Darüber hinaus sind drei Schritte in dieser inzwischen allgegenwärtigen Methodik enthalten, um die Gesamtvirusausbeute zu erhöhen, das Risiko von Ausfällungen aufgrund kontaminierender Proteine zu verringern bzw. das Endprodukt des Virus weiter zu konzentrieren: Ausfällung von Viruspartikeln aus Zellmedien unter Verwendung einer Lösung aus Polyethylenglykol (PEG) und Natriumchlorid, Einführung einer zweiten Runde der Iodixanol-Dichtegradientenzentrifugation, und Pufferaustausch über einen Zentrifugalfilter. Mit dieser Methode ist es möglich, konsistent Titer im Bereich von 10^{bis 12} Viruspartikeln/ml von außergewöhnlicher Reinheit für die In-vivo-Anwendung zu erreichen.

Rekombinante adeno-assoziierte virale (rAAV) Vektoren sind weit verbreitete Instrumente zur Behandlung genetischer Erkrankungen, einschließlich spinaler Muskelatrophie, Netzhautdystrophie und Hämophilie A ^1,2,3. rAAV-Vektoren sind so konstruiert, dass ihnen virale Gene fehlen, die in Wildtyp-AAV⁴ vorhanden sind, einem kleinen, nicht umhüllenden Ikosaedervirus mit einem linearen einzelsträngigen 4,7 kb DNA-Genom. AAV wurde erstmals in den 1960er Jahren als Kontaminante von Adenovirus-Präparaten entdeckt⁵. Trotz seiner kleinen Kapsidgröße, die die Größe des Transgens, das ohne ITRs verpackt werden kann, auf maximal 4,9 kb begrenzt⁶, ist AAV für die Transgenabgabe nützlich, da es beim Menschen nicht pathogen ist, die Expression des Transgens in vielen sich teilenden und nicht teilenden Zelltypen ermöglicht und begrenzte immunogene Wirkungen hat⁷.

Als Mitglieder der Gattung Dependoparvovirus hängt die Produktion von rAAVs von der Expression von Helfergenen ab, die im Adenovirus oder Herpes-simplex-Virus^{vorhanden sind 8}. Es wurden mehrere Strategien zur Herstellung von rAAV entwickelt, aber die Produktion in HEK293-Zellen, die mit den adenoviralen E1A/E1B-Helfergenen transformiert wurden, ist die etablierteste Methode, die heute verwendet wird⁹. Der allgemeine Ansatz der rAAV-Produktion beginnt mit der Transfektion von HEK293-Zellen mit drei Plasmiden, die das Transgen in invertierten terminalen Wiederholungen (ITRs), AAV-Rep- und Cap-Genen bzw. zusätzlichen adenoviralen Helfergenen enthalten. Zweiundsiebzig Stunden nach der Transfektion werden die Zellen geerntet und verarbeitet, um rAAV zu reinigen, das das Transgen enthält.

Bei der Entwicklung neuer rAAV-Vektoren für therapeutische Zwecke ist ein wesentliches Ziel die Herstellung von Vektoren mit erhöhter Transduktionseffizienz. Eine Erhöhung der Transduktionseffizienz von Zielzellen würde eine Verringerung der erforderlichen klinischen Dosis von rAAV bedeuten und somit die Wahrscheinlichkeit unerwünschter immunogener Wirkungen verringern, die von Antikörper-vermittelter Neutralisation bis hin zu akuten Toxizitäten reichen^10,11. Um die Transduktionseffizienz von rAAV-Vektoren zu verbessern, können Änderungen am verpackten Genom oder am Kapsid vorgenommen werden. Praktikable Methoden zur Abstimmung der Transduktionswirksamkeit über das Design des verpackten Genoms umfassen den Einbau starker und gewebespezifischer Promotoren, die sorgfältige Auswahl von mRNA-Verarbeitungselementen und die Optimierung der Kodierungssequenz zur Verbesserung der Translationseffizienz¹². Veränderungen am Kapsid werden mit dem Ziel vorgenommen, den Tropismus für menschliche Zielzelltypen zu erhöhen. Die Bemühungen zur Entwicklung neuer rAAV-Transgen-Verabreichungsvektor-Kapside sind im Allgemeinen gekennzeichnet durch einen Fokus entweder auf das rationale Design von AAV-Kapsiden mit spezifischen Mutationen, die auf spezifische Zellrezeptoren abzielen, oder auf die gerichtete Evolution zur Identifizierung von Kapsiden mit Tropismus für bestimmte Zelltypen aus hochkomplexen kombinatorischen Kapsidbibliotheken, ohne auf einen bestimmten Rezeptor abzuzielen (obwohl einige Gruppen diese Ansätze kombinieren)^{13, 14,15}. Beim gerichteten Evolutionsansatz werden kombinatorische Kapsidbibliotheken unter Verwendung eines bestimmten Serotyp-Rückgrats mit mutierten variablen Regionen an der Kapsidaußenseite^{konstruiert 16}. Kombinatorische Kapsidbibliotheken werden häufig aus AAV-Serotypen konstruiert, die nicht vom Menschen stammen, wodurch das Risiko einer bereits bestehenden Immunität während der klinischen Anwendung verringert^{wird 10}. Daher sind Aufreinigungsmethoden, die auf jeden Serotyp angewendet werden können, ideal, um die Notwendigkeit einer serotypspezifischen Optimierung für die weniger häufig verwendeten Serotypen, die als Rückgrat für diese Bibliotheken dienen, zu eliminieren.

Die Iodixanol-Dichtegradientenzentrifugation wird verwendet, um hohe Titer von rAAV mit hoher Infektiosität^{zu reinigen 17}. In diesem Protokoll wird rAAV in Suspensionszellkultur hergestellt, um den Arbeitsaufwand für die Herstellung großer AAV-Titer zu verringern. Ein Zentrifugationsschritt ist ebenfalls enthalten, um Zelllysat zu reinigen, um das Vorhandensein kontaminierender Proteine zu reduzieren und das Risiko einer Virusausfällung zu verringern. Dieses Protokoll ist eine kostengünstige Methode zur Herstellung von Präparaten aus hochreinem rAAV, die für den präklinischen Einsatz geeignet sind.

Die Zusammensetzung der in diesem Protokoll verwendeten Lösungen und Puffer ist in Tabelle 1 angegeben.

Tabelle 1: Lösungszusammensetzungen für Lösungen, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. Dreifache Transfektion von Expi293-Zellen

1. Expi293-Zellen (siehe Materialtabelle) mit einer Anfangsdichte von 5 x 10⁵ lebensfähigen Zellen (vc)/ml ausseeden.
2. Lassen Sie die Zellen bei 37 °C mit 8 % CO₂ und einer Schütteldrehzahl von 125 U/min inkubieren, bis sie eine Dichte von 3-5 x 10⁶ vc/ml erreichen. Überwachen Sie die Zelldichte und -viabilität mithilfe des Trypanblau-Ausschlusses mit einem automatisierten Zellzähler (siehe Materialtabelle).
3. Wenn die Zellen die gewünschte Zelldichte erreicht haben, teilen Sie sie 1 bis 10 auf, indem Sie frisches Medium hinzufügen, so dass ihr Gesamtvolumen das Zehnfache ihres ursprünglichen Volumens beträgt. Falls erforderlich, werden die Zellen in einen größeren Kolben überführt. Zurück zur Inkubation.
4. Die Zellen werden wie in den Schritten 1.2 bis 1.3 beschrieben weiter expandiert, bis sie eine Dichte von mindestens 2 x 10⁶ vc/ml in 250 ml Medien in einem 1-Liter-Kolben erreichen.
5. Verdünnen Sie die Zellen am Tag vor der Transfektion auf 2 x 10⁶ vc/ml in 250 ml Medien und verwerfen Sie überschüssige Zellen nach Bedarf. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht.
6. Am Tag der Transfektion die Hälfte der Zellen bei 58 x g für 5 min bei 18 °C zentrifugieren. Resuspendieren Sie das Zellpellet im gleichen Volumen (125 ml) Frischmedium. Die Zellviabilität sollte nahe bei 98% liegen.
7. Bereiten Sie zwei konische 50-ml-Röhrchen vor. Beschriften Sie einen mit "PEI" und den anderen mit "DNA".
8. In dem konischen Röhrchen mit der Bezeichnung PEI 1,2 ml PEI (Polyethylenimin, siehe Materialtabelle) auf ein Gesamtvolumen von 12,5 ml in OptiMEM-Medien verdünnen.
9. Bereiten Sie in dem konischen Röhrchen mit markierter DNA eine äquimolare Lösung von Plasmid-DNA zu insgesamt 500 μg DNA in einem Gesamtvolumen von 12,5 ml in OptiMEM-Medien vor.
10. Geben Sie die DNA-Lösung in die PEI-Lösung, invertieren Sie sie mehrmals, um sie gründlich zu kombinieren, und lassen Sie sie 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
    HINWEIS: Es ist wichtig, dass die DNA-PEI-Lösung die vollen 10 Minuten inkubieren kann, damit PEI geladene Komplexe mit der DNA bilden kann.
11. Nachdem die DNA-PEI-Lösung 10 Minuten lang inkubiert wurde, tragen Sie die DNA-PEImax-Lösung mit einer serologischen Pipette langsam auf die Expi293-Zellen auf. Die transfizierten Zellen werden wieder in den Inkubator gegeben und 72 Stunden lang inkubiert (Abbildung 1).

Abbildung 1: Expi293-Zellen, die GFP zwei Tage nach der Transfektion exprimieren. Nach der Transfektion mit einem Plasmid, das ein Gen für GFP enthält, exprimieren die Expi293-Zellen vorübergehend eGFP. Die Zellmorphologie ist rund. Das Bild wurde mit einer Belichtungszeit von 15 ms aufgenommen. Die Mikroskopbilder werden mit einem inversen Mikroskop aufgenommen, das mit Epifluoreszenzbeleuchtung und einem 10x/0,30-Objektiv ausgestattet ist. Maßstabsbalken = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. Aufreinigung von rAAV-Vektoren

1. Nach 72 h werden die Zellen in Suspension in zwei konische 250-ml-Röhrchen überführt und 10 min bei 415 x g bei 4 °C heruntergeschleudert.
2. Das überstehende Medium wird in ein frisches konisches 500-ml-Röhrchen gegossen und zur späteren Verarbeitung bei 0 °C auf Eis gelagert.
3. Resuspendieren Sie jedes Zellpellet in 10 ml AAV-Lysepuffer (Tabelle 1). Sammeln Sie die beiden Lysate zusammen in einem der Röhrchen. Spülen Sie das andere Röhrchen mit zusätzlichen 5 ml AAV-Lysepuffer und fügen Sie es dann zu den gepoolten Lysaten hinzu. Bei -70 °C einfrieren.
   HINWEIS: Das Experiment kann an dieser Stelle angehalten werden. Lagern Sie die überstehenden Medien bei -70 °C und nicht auf Eis.
4. Geben Sie 1:4 Volumen AAV-Fällungslösung in das überstehende Medium aus Schritt 2.2. Mehrmals umdrehen, gründlich mischen und bei 0 °C auf Eis mindestens 2 h oder über Nacht inkubieren.
5. Die inkubierte Lösung bei 3000 x g für 1 h bei 4 °C zentrifugieren.
6. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet mit viralem Niederschlag in 5 ml AAV-Lysepuffer.
7. Das Zelllysat bei 37 °C im Wasserbad auftauen.
8. Poolen Sie den Virusniederschlag mit dem Zelllysat. Dies ist das Rohlysat. Spülen Sie das Zentrifugationsröhrchen, das den viralen Niederschlag enthielt, mit zusätzlichen 5 ml AAV-Lysepuffer und füllen Sie es mit dem Rohlysat.
9. Das Rohlysat auf -70 °C einfrieren und dann bei 37 °C auftauen. Wiederholen Sie diesen Zyklus noch einmal.
   HINWEIS: Das Rohlysat sollte nicht länger bei 37 °C belassen werden, als es zum Auftauen erforderlich ist.
10. Nach dem dritten Auftauen sofort 4 μl Benzonase zum Rohlysat geben, zum Mischen invertieren und 30 Minuten bei 37 °C inkubieren.
11. Das Rohlysat wird 10 min lang bei 650 x g bei 18 °C zentrifugiert.
12. Übertragen Sie den Überstand in ein sauberes konisches 50-ml-Röhrchen. Das ist das rohe Virus. Entsorgen Sie das Pellet.
13. Zentrifugieren Sie das Rohvirus für weitere 30 Minuten bei 3000 x g bei 18 °C, um kontaminierende Proteine zu entfernen.
14. Übertragen Sie den Überstand in ein sauberes konisches 50-ml-Röhrchen. Dies ist das geklärte Virus.
    HINWEIS: Das Experiment kann an dieser Stelle angehalten werden. Frieren Sie das geklärte Virus auf -70 °C ein.
15. Richten Sie die Mehrkanal-Schlauchpumpe mit vier Schlauchschläuchen ein (siehe Materialtabelle). Befestigen Sie Kapillaren an beiden Enden jedes Röhrchens.
16. Legen Sie die Kapillaren auf der Eingangsseite der Pumpe in ein mit deionisiertem Wasser gefülltes Becherglas. Legen Sie die Kapillaren auf der Ausgangsseite der Pumpe in ein leeres Becherglas. Lassen Sie die Schlauchpumpe mit 25,0 U/min laufen, um den Schlauch mit deionisiertem (DI) Wasser zu spülen.
17. Entleeren Sie nach gründlicher Spülung den Schlauch, indem Sie die Pumpe laufen lassen, bis der Schlauch nur noch mit Luft gefüllt ist. Legen Sie alle Kapillaren auf ein sauberes, fusselfreies Tuch.
18. Legen Sie vier Ultrazentrifugenröhrchen in ein Gestell auf der Ausgangsseite der Pumpe.
19. Verwenden Sie eine serologische 10-ml-Pipette, um vorsichtig 10 ml geklärtes Virus in jedes Ultrazentrifugenröhrchen zu dosieren. Achten Sie darauf, keine Luftblasen einzuführen.
    HINWEIS: Das Volumen des geklärten Virus in jedem Röhrchen kann bei Bedarf auf bis zu 12 ml pro Röhrchen gedehnt werden. Reduzieren Sie die Menge von 60% Iodixanol entsprechend in Schritt 2.25 unten.
20. Das geklärte Virus wird mit Hilfe der Peristaltikpumpe mit Iodixanolfraktionen (Tabelle 1) von der niedrigsten bis zur höchsten Dichte unterlegt. Zuerst wird die 15%-Fraktion hinzugefügt, gefolgt von der 25%-Fraktion, der 40%-Fraktion und schließlich der 60%-Fraktion. 22 ml (5,5 ml pro Ultrazentrifugenröhrchen) der 15%igen Iodixanolfraktion in ein sauberes konisches 50-ml-Röhrchen überführen. Legen Sie die Kapillaren auf der Eingangsseite der Pumpe in den Schlauch und achten Sie darauf, dass alle Kapillaren den Boden des Schlauchs berühren.
21. Starten Sie die Pumpe und lassen Sie den Schlauch mit der Iodixanolfraktion füllen. Wenn die Iodixanolfraktion die Enden der Kapillaren auf der Ausgangsseite der Pumpe erreicht, stoppen Sie die Pumpe.
22. Führen Sie eine Ausgangskapillare in jedes Ultrazentrifugenröhrchen mit geklärtem Virus ein und achten Sie darauf, dass die Kapillaren den Boden jedes Ultrazentrifugenröhrchens berühren.
    HINWEIS: Es ist von entscheidender Bedeutung, dass sich keine Luft mehr in den Kapillaren befindet. Iodixanol kann mit leicht unterschiedlichen Geschwindigkeiten durch den Peristaltikschlauch fließen, stellen Sie also sicher, dass jede einzelne Ausgangskapillare vollständig mit Iodixanol gefüllt ist, bevor Sie es in das geklärte Virus einführen. Es kann erforderlich sein, die Pumpe mehrmals zu stoppen und zu starten.
23. Starten Sie die Pumpe und lassen Sie die Ultrazentrifugenröhrchen füllen. Wenn der letzte Teil der 15%igen Fraktion in die Eingangskapillaren aufgenommen werden soll, stoppen Sie die Pumpe. Es ist wichtig, dass keine Luftblasen in den Schlauch gelangen.
    Anmerkungen: Wenn Luftblasen in die Eingangskapillaren gelangen, kann die Pumpe kurz in umgekehrter Richtung betrieben werden, um sie wieder herauszudrücken.
24. 22 ml (5,5 ml pro Ultrazentrifugenröhrchen) der 25%igen Iodixanolfraktion in das konische 50-ml-Röhrchen überführen. Achten Sie darauf, dass alle Kapillaren den Boden des Schlauchs berühren, und starten Sie die Pumpe. Wenn der letzte Teil der 25%igen Fraktion in die Eingangskapillaren aufgenommen werden soll, stoppen Sie die Pumpe.
25. Schritt 2.24 wird mit 20 ml (5 ml pro Ultrazentrifugenröhrchen) der 40%igen Iodixanolfraktion und dann mit 24 ml (6 ml pro Ultrazentrifugenröhrchen) der 60%igen Fraktion wiederholt.
26. Wenn im Ultrazentrifugenröhrchen noch ungefülltes Volumen vorhanden ist, fügen Sie weitere 60%ige Fraktion hinzu, bis die Ultrazentrifugenröhrchen vollständig mit Flüssigkeit gefüllt sind.
27. Füllen Sie jedes Röhrchen, bis das Lysat eine Kuppel bildet, aber nicht aus dem Röhrchen überläuft. Stoppen Sie die Pumpe und entfernen Sie vorsichtig jede Ausgangskapillare, wobei Sie darauf achten, den Iodixanolgradienten nicht zu stören.
28. Verschließen Sie jedes Ultrazentrifugenröhrchen mit einem Abstandshalter und laden Sie es in einen Ti-Rotor vom Typ 70 (siehe Materialtabelle).
    Anmerkungen: Stellen Sie sicher, dass der Rotor richtig ausgewuchtet ist. Versuchen Sie nicht, die Ultrazentrifuge ohne entsprechende Schulung zu bedienen.
29. Laden Sie den Typ 70 Ti-Rotor in die Ultrazentrifuge und zentrifugieren Sie ihn bei 489.000 x g für 1 h bei 18 °C.
30. Entladen Sie den Rotor nach der Zentrifugation von der Ultrazentrifuge. Entfernen Sie jedes Ultrazentrifugenröhrchen vorsichtig mit einer Spitzzange vom Rotor und achten Sie darauf, den Iodixanolgradienten nicht zu stören.
31. Verwenden Sie einen Stützringständer mit Klemme, um ein Ultrazentrifugenröhrchen zu sichern.
32. Befestigen Sie eine 20-GA-Nadel an einer 5-ml-Spritze und legen Sie sie beiseite. Verwenden Sie ein fusselfreies Tuch, um die Kappe vom Ultrazentrifugenröhrchen zu entfernen.
33. Durchdringen Sie die Wand des Ultrazentrifugenröhrchens mit der Nadel etwa 3 mm unterhalb der 40%-60%igen Iodixanol-Grenzfläche (Abbildung 2).
34. Saugen Sie die Grenzfläche und einen Teil der 40%-Fraktion langsam an. Vermeiden Sie es, die Oberseite der 40%igen Fraktion anzusaugen, um eine Gesamtentnahme von etwa 4 ml zu erzielen.
35. Halten Sie einen Finger über die offene Oberseite des Ultrazentrifugenröhrchens, ziehen Sie die Spritze heraus und übertragen Sie die aspirierte AAV-Fraktion in ein konisches 50-ml-Röhrchen. Entsorgen Sie die Spritze in einem Behälter für scharfe Gegenstände. Entsorgen Sie das Ultrazentrifugenröhrchen.
36. Wiederholen Sie die Schritte 2.31-2.35 für jedes Ultrazentrifugenröhrchen.
37. Verdünnen Sie die aspirierte AAV-Fraktion ungefähr um das Zweifache in AAV-Lysepuffer auf ein Volumen von 40 ml.
38. Spülen Sie den Schlauch wie in den Schritten 2.16-2.17 beschrieben.
    HINWEIS: Das Experiment kann an dieser Stelle angehalten werden. Die verdünnte AAV-Fraktion über Nacht bei 0 °C lagern.
39. Laden Sie jeweils 20 ml der verdünnten AAV-Fraktion in zwei neue Ultrazentrifugenröhrchen.
40. Für die zweite Runde der Iodixanol-Dichtegradientenzentrifugation wird die verdünnte AAV-Fraktion wie oben beschrieben mit nur 10 ml (5 ml pro Ultrazentrifugenröhrchen) der 40%igen Fraktion und 14 ml (7 ml pro Ultrazentrifugenröhrchen) der 60%igen Fraktion unterlegt. Wiederholen Sie die Schritte 2.29-2.36 für die Ultrazentrifugation und Aspiration.
    Anmerkungen: Spülen Sie vor der Lagerung der Schlauchpumpe und des Schlauchs den Schlauch mit DI-Wasser aus, wie in den Schritten 2.16-2.17 beschrieben.

Abbildung 2: Iodixanol-Gradient mit markierter 40%-60%-Iodixanol-Grenzfläche. (A) Erster Iodixanol-Gradient. Phenolrot wird in den Fraktionen 40% Iodixanol und 60% Iodixanol verwendet. Es erscheint aufgrund des unterschiedlichen pH-Werts zwischen den beiden Fraktionen als eine andere Farbe. Der Pfeil zeigt an, wo die Spritze eingeführt werden sollte, um die rAAV-Fraktion zu ernten, direkt unter der Grenzfläche von 40 % bis 60 % Iodixanol. (B) Zweiter Iodixanol-Gradient. In diesem Schritt werden nur die 40%igen und 60%igen Iodixanolfraktionen verwendet. Der Pfeil zeigt an, wo die Spritze eingeführt werden sollte, um die rAAV-Fraktion zu ernten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

3. Pufferaustausch und Viruskonzentration

1. Nachdem Sie die AAV-Fraktion aus der zweiten Runde der Iodixanol-Dichtegradientenzentrifugation erhalten haben, verdünnen Sie sie zweifach mit AAV-Pufferlösung.
2. Äquilibrieren Sie den Zentrifugalfilter, indem Sie 20 ml AAV-Pufferlösung auf die Oberseite des Filters geben. Das Gerät wird bei 3000 x g bei 18 °C 5 min lang zentrifugiert und der Durchfluss verworfen.
3. Geben Sie die verdünnte AAV-Fraktion in den Zentrifugalfilter. Das Gerät wird bei 3000 x g bei 18 °C 5 min lang zentrifugiert und der Durchfluss verworfen.
4. Geben Sie 20 ml AAV-Pufferlösung oben in den Filter. Das Gerät wird bei 3000 x g bei 18 °C 5 min lang zentrifugiert und der Durchfluss verworfen.
   Anmerkungen: Wenn die Zentrifugalfiltermembran verstopft ist und die Lösung ineffizient durchfließt, verwenden Sie vorsichtig eine P200-Mikropipette, um die Lösung oben im Filter auf und ab zu ziehen. Achten Sie darauf, den Filter nicht mit der Mikropipettenspitze zu berühren.
5. Wiederholen Sie Schritt 3.4 noch zweimal.
   Anmerkungen: Stellen Sie sicher, dass das AAV nicht überkonzentriert ist, indem Sie mindestens 1 ml Volumen oben im Filter halten. Es kann notwendig sein, die Zentrifugationszeiten anzupassen, um eine Überkonzentration zu vermeiden. Wenn AAV überkonzentriert ist, kann es zu Niederschlägen kommen.
6. Für einen Endtiter im Bereich von 10^{bis 12} vg/ml wird das Virus auf ein Endvolumen von etwa 1 ml heruntergeschleudert.
   HINWEIS: Abhängig vom verwendeten Serotyp-Rückgrat und der Verpackungseffizienz des Virus müssen Sie das Virus möglicherweise in einem kleineren Volumen konzentrieren.
7. Verwenden Sie eine p1000-Mikropipette, um das konzentrierte AAV von der Oberseite des Zentrifugalfilters in ein Mikrozentrifugenröhrchen zu übertragen. Verwenden Sie eine p200-Mikropipette, um den Zentrifugalfilter mit 50 μl AAV-Puffer zu waschen, um verbleibende Viren aufzufangen und mit dem Rest des konzentrierten AAV zu sammeln.
8. Ein 2 μl Aliquot des konzentrierten AAV zum Titern beiseite stellen. In der ergänzenden Tabelle 1 finden Sie ITR-Primer, die für die qPCR verwendet werden können.
9. Führen Sie das konzentrierte AAV durch einen 0,2-μm-Spritzenvorsatzfilter, um es zu sterilisieren.
   HINWEIS: Achten Sie bei der Sterilisation eines kleinen Volumens darauf, einen Spritzenvorsatzfilter mit kleinem Durchmesser zu wählen, um den Virusverlust zu minimieren. Die Verwendung eines proteinarmen Bindungsfilters mit kleinem Durchmesser führt zu minimalem Virusverlust (Daten nicht gezeigt).
10. Das sterilisierte AAV kann sofort zur Zelltransduktion verwendet oder bei 4 °C gelagert werden, um innerhalb von vier Wochen verwendet zu werden. Für eine längerfristige Lagerung sollte es bei -70 °C gelagert werden.

Mit dieser Methode können Titer von mindestens 10^{bis 12} Viruspartikeln pro ml erhalten werden. Ein Titer kann (Abbildung 3) durch qPCR unter Verwendung der in der ergänzenden Tabelle 1 angegebenen ITR-Primer, durch ddPCR oder durch eine andere Titermethode erhalten werden. Suboptimale Titer könnten sich aus der Verwendung eines Cap-Gens ergeben, das für ein Kapsid mit schlechter Verpackungseffizienz kodiert.

Eine weitere mögliche Quelle für suboptimale Ergebnisse ist die schlechte Transduktionseffizienz von Expi293-Zellen. Es wird empfohlen, am Tag der Transfektion Zellen mit einer Dichte von 3-4 x 10⁶ vc/ml zu haben und die Zellviabilität liegt bei fast 98%. In der vorliegenden Studie erhielten die Autoren nach diesem Protokoll einen Titer von 1,07 x 10¹² vg. Diese Ausbeute stimmt mit früheren Erträgen überein, die mit der Verpackung AAVrh74¹⁸ erzielt wurden.

Abbildung 3: Titerbestimmung mittels qPCR. Kurve 1 wurde mit einer Standardkonzentration von 3,66 x 10¹¹ vg/ml erzeugt, Kurve 2 mit einer Standardkonzentration von 3,66 x 10¹⁰ vg/ml, Kurve 3 war die endgültige konzentrierte AAV-Probe, Kurve 4 wurde mit einer Standardkonzentration von 3,66 x 10⁹ vg/ml und Kurve 5 mit einer Standardkonzentration von 3,66 x 10⁸ vg/ml erzeugt. Jede qPCR-Reaktion wurde in zweifacher Ausführung durchgeführt. (A) qPCR-Amplifikationskurve. Die Standards wurden durch serielle Verdünnung eines durch ddPCR titterierten AAV-Standards erzeugt. Die Konzentration des unverdünnten Standards betrug 3,66 x 10¹² vg/ml. (B) Standardkurve, die durch qPCR erzeugt wurde. Das produzierte AAV wurde mit einer Konzentration von 1,85 x 10¹¹ vg/ml in 5,75 ml bestimmt, was einer Gesamtausbeute von 1,07 x 10¹² vg entspricht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Tabelle 1: Vorwärts- und Rückwärts-Primersequenzen für AAV-invertierte terminale Wiederholungen (ITRs). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Das Protokoll zur doppelten Iodixanol-Dichtegradientenreinigung ist die universelle Methode, da es auf alle AAV-Mutantenvarianten anwendbar ist, unabhängig von ihrer Rezeptorspezifität. Frühe Methoden der AAV-Reinigung beruhten auf der Partikeldichte und umfassten die isopyknische Zentrifugation in CsCl und die kontinuierliche Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation¹⁹. Später wurden Serotyp-spezifische Ansätze entwickelt, bei denen monoklonale Antikörper verwendet wurden, die an Sepharosesäulen gebunden waren²⁰. Eine neuartige dichtebasierte Reinigungsmethode mit einem diskontinuierlichen Iodixanol-Gradienten wurde 1999 entwickelt und lieferte AAV-Isolate mit höherer Infektiosität als solche, die aus CsCl-Gradienten isoliert wurden²¹. Die Methoden zur Aufreinigung von AAV wurden bis in die frühen 2000er Jahre weiterentwickelt, da einige Gruppen Hochleistungsflüssigkeitschromatographie zur Reinigung von rAAV mit einer Rückgewinnung aus Rohlysat von mehr als 70 % verwendeten22,23,24. Diese Methoden werden immer noch in großtechnischen Fertigungsprozessen verwendet²⁵. Trotz der Entwicklung von Chromatographiemethoden zur Isolierung von AAV ist die Aufreinigung durch Iodixanol-Dichtegradientenzentrifugation aufgrund ihrer geringeren Kosten und des Serotyp-Agnostizismus immer noch weit verbreitet^26,27.

Diese Methode eignet sich zwar gut für die zeiteffiziente präklinische Herstellung von rAAV, ist jedoch in ihrer Skalierbarkeit und Anpassungsfähigkeit für die cGMP-Herstellung sehr begrenzt²⁵. Daher werden, wie oben beschrieben, andere Reinigungsmethoden für die Großproduktion bevorzugt. Darüber hinaus ist die transgene Kapazität von rAAV-Vektoren begrenzt. Die Größenbeschränkung für ein AAV-Genom, das intakt verpackt werden kann, liegt bei etwa 5,2 kb für eine maximale Transgengröße von 4,9 kb, was den ITRs⁶ entspricht. Dies erschwert die Expression von Proteinen, deren cDNA diese Kapazität übersteigt. Diese Proteine können von dem hier beschriebenen System nicht ohne Modifikation des Transgens selbst oder die Verwendung eines Split-Vektorsystems exprimiert werden. Chamberlain et al. beschreiben mehrere Methoden zur Expression von Transgenen, die größer als 4,9 kb^{sind 28}.

Diese Methode ist besonders nützlich für die Herstellung hochkomplexer kombinatorischer Kapsidbibliotheken, die AAV-Kapside mit unterschiedlichen biochemischen Eigenschaften aufgrund von Mutationen auf der Kapsidoberfläche enthalten. Wenn das rAAV-Präparat für die Injektion bei Tieren, insbesondere bei nichtmenschlichen Primaten, bestimmt ist, ist es wichtig, die Endotoxinkontamination zu begrenzen. Es muss sehr sorgfältig darauf geachtet werden, die Bereiche, in denen Bakterienkulturen gezüchtet werden, von der rAAV-Produktion zu trennen, um eine bakterielle Kontamination bei allen Schritten zu verhindern. Führen Sie alle Arbeiten mit menschlichen Zellen und rohem AAV in einer Biosicherheitswerkbank mit Einwegplastik durch. Dies verhindert eine bakterielle Kontamination und ist eine Notwendigkeit für die Arbeit mit AAV, da es sich um einen BSL1-Wirkstoff handelt.

Wenn ein Labor keinen Zugang zu einem CO_{2 -} Inkubator mit Schüttler hat, kann eine adhärente Zellkultur mit HEK293-Zellen anstelle der Expi293-Suspensionszellkultur verwendet werden. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers für die Subkultivierung und verwenden Sie das in Crosson et al., 2018¹⁷ beschriebene Transfektionsprotokoll.

Kritische Schritte in diesem Protokoll sind die Expi293-Transfektion, die Vorbereitung des Iodixanol-Gradienten und die Aspiration der Oodixanol-Fraktion, die AAV enthält. Fehler während eines dieser Schritte können zu suboptimalen rAAV-Ausbeuten oder zum Ausfall der rAAV-Produktion führen.

Die Transfektion der Expi293-Zellen ist ein kritischer Schritt bei der Herstellung von rAAV unter Verwendung dieses Protokolls. Am Tag der Transfektion werden die Zellen in einem halben Volumen frischer Medien resuspendiert, um sie mit den Nährstoffen zu versorgen, die sie benötigen, um sich von der Transfektion^{zu erholen 29}; Die Transfektion ist ein sehr anstrengender Prozess für die Zellen. Das konditionierte Medium wird jedoch nicht vollständig verworfen, da es Wachstumsfaktoren und andere Metaboliten enthält, die für die Zellerhaltung und das Zellwachstum wichtig sind. Es ist wichtig, dass PEI und DNA volle zehn Minuten lang inkubieren, bevor sie auf Zellen aufgetragen werden, um einen geladenen Komplex³⁰ zu bilden. Ohne die Bildung eines Komplexes mit PEI wird die DNA nicht effizient von den Zellen aufgenommen.

Bei der Herstellung von rAAV hängt der Anteil des in den Medien gefundenen Virus von den Wechselwirkungen des jeweiligen Serotyps mit Expi293-Zellrezeptoren ab. Einige Serotypen werden mit höheren Raten in Zellmedien freigesetzt als andere³¹, was die Ausfällung von Viruspartikeln aus Zellmedien erfordert, um die höchstmögliche Ausbeute zu erzielen und den Verlust von Varianten aufgrund mangelnder Affinität zu Expi293-Zellrezeptoren zu verhindern. Im Gegensatz dazu weist der Serotyp AAV2 starke Rezeptorwechselwirkungen mit Heparansulfat-Proteoglykanen auf, die in 293 Zellen vorhanden sind, so dass nur sehr wenige verpackte Viren in den Medien gefunden werden³². Wenn Sie ein Derivat von AAV2 herstellen, lassen Sie den PEG-Fällungsschritt aus. Für die Herstellung von kombinatorischen Kapsidbibliotheken oder rAAV alternativer Serotypen ist die Ausfällung von Viruspartikeln mit PEG geeignet.

Es ist wichtig, dass 1 M Natriumchlorid in der 15%igen Iodixanolfraktion vorhanden ist, um aggregierte AAV-Partikel während der Ultrazentrifugation zu dissoziieren. Das Weglassen von NaCl in dieser Fraktion kann zu unerwünschten Ergebnissen führen, wie z. B. einer Abnahme der Transduktionseffizienz und Immunogenität³³. Seien Sie schließlich sehr vorsichtig beim Ansaugen von AAV aus dem Iodixanol-Gradienten. Das Ansaugen einer zu großen Menge der Iodixanolfraktion kann zum Vorhandensein leerer Kapside im Endprodukt^{führen 17}.

Diese Methode kann verwendet werden, um kombinatorische rAAV-Kapsidbibliotheken für die Verwendung in nachgelagerten Evolutionsexperimenten zu verpacken, um Kapside mit höherem Tropismus für bestimmte menschliche Zelltypen zu identifizieren. rAAV ist bei 4 °C für den kurzfristigen Gebrauch und bei -70 °C für die Langzeitlagerung stabil³⁴. Derzeit wird das rekombinante AAV in fünf von der FDA zugelassenen Medikamenten zur Behandlung von Erkrankungen eingesetzt^, darunter Duchenne-Muskeldystrophie ^35,36,37. Es gibt mehrere zusätzliche rAAV-Therapien in klinischen und präklinischen Studien 38,39,40. Weitere Forschungen zu diesem Vektor sind daher entscheidend für die Entwicklung weiterer Gentherapien.

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Nichts.