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Dieses Manuskript stellt eine Reihe von hochgradig reproduzierbaren Verhaltenstests vor, um ein Mausmodell mit Angelman-Syndrom zu validieren.
Dieses Manuskript beschreibt eine Reihe von Verhaltenstests, die zur Charakterisierung des Angelman-Syndroms (AS)-ähnlichen Phänotypen in einem etablierten Mausmodell der AS zur Verfügung stehen. Wir verwenden das Rotarod-Lernparadigma, eine detaillierte Ganganalyse und einen Nestbautest, um motorische Beeinträchtigungen bei Tieren zu erkennen und zu charakterisieren. Wir testen die Emotionalität der Tiere im Freiland- und erhöhten Plus-Labyrinth-Tests, sowie die Wirkung im Schwanzaufhängungstest. Wenn AS-Mäuse im Freilandversuch getestet werden, sollten die Ergebnisse mit Vorsicht interpretiert werden, da motorische Dysfunktionen das Verhalten der Mäuse im Labyrinth beeinflussen und die Aktivitätswerte verändern.
Die Reproduzierbarkeit und Wirksamkeit der vorgestellten Verhaltenstests wurde bereits in mehreren unabhängigen Uba3a-Mauslinien mit unterschiedlichen Knockout-Varianten validiert, was diese Testreihe als hervorragendes Validierungswerkzeug in der AS-Forschung etabliert. Modelle mit entsprechender Konstrukt- und Gesichtsvalidität werden weitere Untersuchungen zur Aufklärung der Pathophysiologie der Erkrankung und zur Entwicklung kausaler Therapien rechtfertigen.
Das Angelman-Syndrom (AS) ist eine seltene neurologische Entwicklungsstörung. Der häufigste genetische Ursprung von AS ist eine große Deletion der 15q11-q13-Region des mütterlichen Chromosoms, die bei fast 74 % der Patienten gefunden wird1. Die Deletion dieser Region führt zum Verlust von UBE3A, dem Hauptverursacher von AS, das für eine E3-Ubiquitin-Ligase kodiert. Das väterliche Allel des UBE3A-Gens in Neuronen wird in einem Prozess stillgelegt, der als Prägung bezeichnet wird. Folglich erlaubt die väterliche Prägung des Gens nur die mütterliche Expression im Zentralnervensystem (ZNS)2. Daher führt die Deletion des UBE3A-Gens vom mütterlichen Chromosom zur Entwicklung von AS-Symptomen. Beim Menschen manifestiert sich AS im Alter von etwa 6 Monaten, mit einer Entwicklungsverzögerung, die in allen Entwicklungsstadien anhält und bei den betroffenen Personen zu schweren schwächenden Symptomen führt 3,4. Zu den Kernsymptomen der Störung gehören das Defizit der Fein- und Grobmotorik, einschließlich ruckartiger ataktischer Gang, schwere Sprachstörungen und geistige Behinderung. Etwa 80% der AS-Patienten leiden zudem unter Schlafstörungen und Epilepsie. Bisher gibt es nur symptomatische Medikamente, die epileptische Anfälle reduzieren und die Schlafqualität verbessern1. Daher wird die Entwicklung robuster Tiermodelle mit reproduzierbaren Verhaltensphänotypen zusammen mit einer verfeinerten Phänotypisierungsanalyse unerlässlich sein, um die pathophysiologischen Mechanismen der Störung aufzuklären und wirksame Medikamente und Behandlungen zu finden.
Die Komplexität der menschlichen Erkrankung, die das ZNS betrifft, erfordert, dass Modellorganismen ein vergleichbares Genom, eine vergleichbare Physiologie und ein vergleichbares Verhalten besitzen. Mäuse sind aufgrund ihres kurzen Fortpflanzungszyklus, ihrer geringen Größe und ihrer relativ einfachen DNA-Modifikation als Modellorganismus beliebt. Im Jahr 1984 schlug Paul Willner drei grundlegende Validierungskriterien für Krankheitsmodelle vor: das Konstrukt, das Gesicht und die prädiktive Validität, die verwendet werden, um den Wert des Modells zu bestimmen5. Vereinfacht gesagt, spiegelt die Konstruktvalidität die biologischen Mechanismen wider, die für die Entwicklung der Störung verantwortlich sind, die Gesichtsvalidität rekapituliert ihre Symptome und die prädiktive Validität beschreibt das Ansprechen des Modells auf therapeutische Medikamente.
Um den oben genannten Prinzipien gerecht zu werden, haben wir die häufigste genetische Ätiologie, eine große Deletion des mütterlichen 15q11.2-13q-Locus einschließlich des UBE3A-Gens, gewählt, um AS-Modellmäuse zu erzeugen. Wir verwendeten die CRISPR/Cas9-Technik, um eine 76.225 bp lange Region zu löschen, die sich über das gesamte UBE3A-Gen erstreckt und sowohl die kodierenden als auch die nicht-kodierenden Elemente des Gens umfasst, in Mäusen aus einem C57BL/6N-Hintergrund6. Anschließend haben wir die Tiere gezüchtet, um UBE3A+/− heterozygote Mäuse zu erhalten. Für die Gesichtsvalidierung des Modells verwendeten wir Tiere aus Kreuzungen von UBE3A+/−-Weibchen und Wildtyp-Männchen, um UBE3A+/- Nachkommen (Stamm mit der Bezeichnung C57BL/6NCrl-UBE3A/Ph und später als UBE3A mGenedel/+ bezeichnet) und Kontrollwurfgeschwister zu gewinnen. Wir testeten ihre Fein- und Grobmotorik, ihre Emotionalität und ihren Affekt, um die Kernsymptome des AS zu rekapitulieren. In einem früheren Artikel haben wir auch die kognitiven Funktionen der Tiere untersucht, da AS-Patienten auch an einer geistigen Behinderung leiden6. Wir fanden jedoch keine kognitiven Beeinträchtigungen bei UBE3AmGenedel/+ Mäusen, was möglicherweise auf das junge Alter der Tiere zum Zeitpunkt des Versuchs zurückzuführenist 7. Eine spätere Untersuchung der älteren Tiere, die etwa 18 Wochen alt waren, ergab ein Defizit in der Verhaltensflexibilität während des Umkehrlernens im Ortspräferenzparadigma. Die Komplexität der für diese Analyse verwendeten Geräte erfordert jedoch ein separates methodisches Modul, das hier nicht enthalten ist.
Die hier vorgestellten Verhaltenstests gehören dank ihres hohen prädiktiven Wertes und ihrer ausreichenden Konstruktvalidität zu den gängigen Phänotypisierungswerkzeugen in der Genforschung 8,9,10. Wir nutzten diese Tests, um ein Mausmodell für AS zu validieren, indem wir die Kernsymptome der menschlichen Krankheit auf reproduzierbare, altersunabhängige Weise rekapitulierten. Die Emotionalität des Tieres wurde im erhöhten Plus-Labyrinth und im Freifeldversuch bewertet. Beide Tests basieren auf dem Annäherungs-Vermeidungs-Konflikt, bei dem die Tiere auf der Suche nach Nahrung, Unterschlupf oder Paarungsmöglichkeiten eine neue Umgebung erkunden und gleichzeitig angstlösende Kompartimente meiden11. Zusätzlich wird der Freilandtest verwendet, um die Bewegungsaktivität einer Maus zu testen8. Der Schwanzsuspensionstest wird häufig in der Depressionsforschung eingesetzt, um nach neuen Antidepressiva oder depressiven Phänotypen in Maus-Knockout-Modellen zu suchen12. Dieser Test bewertet die Verzweiflung, die Tiere im Laufe der Zeit in einer unentrinnbaren Situation entwickeln. Motorisches Lernen und detaillierte Gangeigenschaften wurden auf dem Rotarod bzw. im DigiGait bestimmt. Die Ausdauer des Tieres auf dem beschleunigenden Stab charakterisiert seine Gleichgewichts- und Bewegungskoordinationsfähigkeiten, während die detaillierte Analyse der Schrittmuster einer Maus eine sensible Bewertung neuromuskulärer Beeinträchtigungen im Zusammenhang mit vielen neurogenerativen Bewegungsstörungen darstellt13,14,15. Der Nestlet-Zerkleinerungstest ist Teil der Standardmethodik zur Erkennung impulsiven Verhaltens bei Nagetieren, und da er das natürliche Bauverhalten von Nagetieren nutzt, zeigt er das Wohlbefinden des Tieres an16,17.
Die Größe der Versuchsgruppen war das Ergebnis eines Kompromisses, um die Anforderungen der 3R-Regel zu erfüllen und die Zuchtleistung der Kolonien effizient zu nutzen. Um jedoch eine statistische Aussagekraft zu erhalten, hatten die Gruppen nicht weniger als 10 Individuen, da eine ausreichende Anzahl von Brutpaaren gebildet wurde. Leider führte die Zuchtleistung nicht immer zu einer ausreichenden Anzahl von Tieren.
Alle Tiere und Experimente, die in dieser Studie verwendet wurden, wurden einer ethischen Überprüfung unterzogen und in Übereinstimmung mit der europäischen Richtlinie 2010/63/EU durchgeführt. Die Studie wurde von der Tschechischen Zentralkommission für Tierschutz genehmigt. Die Mäuse wurden in einzeln belüfteten Käfigen untergebracht und bei einer konstanten Temperatur von 22 ± 2 °C mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus gehalten. Die Mäuse wurden ad libitum mit Mäusefutter und Wasser versorgt. Die Mäuse wurden in Gruppen von drei bis sechs Tieren pro Käfig untergebracht. Vor der Prüfung wurde keine andere Handhabung als das Wiegen durchgeführt. In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu allen Materialien und Geräten, die in diesem Protokoll verwendet werden.
1. Allgemeine Erwägungen vor und während der Prüfung
HINWEIS: Aus Gründen der Übersichtlichkeit und Verständlichkeit werden vor der Beschreibung der einzelnen Tests allgemeine Bemerkungen gemacht. Dies gilt für jeden Versuch, mit der offensichtlichen Ausnahme des Nestlet-Zerkleinerungstests, der in einem Stallraum durchgeführt wird und keine Versuchsgeräte erfordert.
2. Verhaltenstests
Erhöhte Plus-, Labyrinth- und Freifeldtests
Die EPM- und OF-Tests nutzen die natürliche Neigung von Nagetieren, neue Umgebungen zu erkunden18,19. Die Erkundung wird von einem Annäherungs-Vermeidungs-Konflikt bestimmt, bei dem Nagetiere zwischen der Erkundung einer neuen Umgebung und der Vermeidung möglicher Gefahren wählen. Tiere erkunden unbekannte Orte auf der Suche nach Unterschlupf, sozialen Kontakten oder Nahrungssuche. Neue Orte können jedoch Risikofaktoren wie Raubtiere oder Konkurrenten beinhalten. Sowohl der OF-Test als auch der EPM bestehen aus sicheren und riskanten Kompartimenten – der Peripherie und der Mitte im OF-Test und geschlossenen und offenen Armen im EPM. Nagetiere bevorzugen von Natur aus dunkle, geschlossene Fächer im Vergleich zu offenen, erhöhten und hell beleuchteten Bereichen. So charakterisiert eine reduzierte Exploration der riskanten/angstabhängigen Anteile, ausgedrückt als Abnahme der Anzahl der Besuche und der Besuchsdauer oder als erhöhte Latenz bis zum ersten Besuch, das angstähnliche Verhalten der Tiere 8,11. Die Ruhezeit, die Durchschnittsgeschwindigkeit und die zurückgelegte Gesamtstrecke liefern zusätzliche Informationen über die spontane Aktivität der Tiere. Keiner der Parameter, die sich auf angstähnliches Verhalten beziehen, war in UBE3AmGenedel/+ Mutanten weder im OF-Test noch im EPM verändert (Abbildung 1D-G). UBE3AmGenedel/+-Tiere zeigten jedoch eine signifikante Hypoaktivität, was sich in einer kürzeren zurückgelegten Strecke, einer niedrigeren Durchschnittsgeschwindigkeit und einer längeren Ruhezeit im OF-Test widerspiegelte (Abbildung 1A-C).
Abbildung 1: Spontane Aktivität und Angstreaktion auf eine neue Umgebung im EPM- und OF-Test. (A-E) Erkundung des offenen Feldes. Die UBE3AmGenedel/+ Tiere liefen eine kürzere Strecke (A) mit einer niedrigeren Durchschnittsgeschwindigkeit (B) und einer längeren Ruhezeit (C). Die Anzahl der Besuche und die Dauer im Zentrum unterschieden sich nicht zwischen den Tieren (D,E). Eine Zwei-Wege-ANOVA ergab einen signifikanten Hauptgenotyp-Effekt ohne signifikante Interaktion zwischen Genotyp und Geschlecht (Genotyp-Effekt: p < 0,01; Genotyp /Geschlechts-Interaktion: p > 0,7). Der prozentuale Anteil der Besuche in offenen und geschlossenen Armen hing nicht vom Genotyp (F) ab, und auch die Zeit, die in den angstlösenden offenen Armen verbracht wurde, unterschied sich nicht zwischen den Versuchsgruppen (G). Eine Zwei-Wege-ANOVA ergab keine signifikanten Haupteffekte oder Genotyp/Geschlechts-Interaktionen (Genotyp-Effekt: p > 0,9; Genotyp/Geschlechts-Interaktion: p > 0,9). Die im Boxplot dargestellten Daten zeigen den Medianwert, den Interquartilsabstand und den Wertebereich. Signifikante Post-hoc-Testergebnisse sind mit * gekennzeichnet. Die Daten für Kontrolltiere (weiblich n = 10, männlich n = 11) sind rot und Mutanten (weiblich n = 9, männlich n = 10) blau dargestellt. Diese Abbildung wurde von Syding et al.6 übernommen. Abkürzungen: EPM = erhöht plus Labyrinth; OF = offenes Feld. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Test der Heckaufhängung
Der TST misst die Verzweiflung von Tieren, die in einer unentrinnbaren Situation entwickelt wurden. Wenn Nagetiere am Schwanz hängen, werden sie nach einer anfänglichen Phase intensiver Aktivität schnell unbeweglich. Die Dauer der Immobilität gibt Aufschluss über das Ausmaß der "Verzweiflung". Zahlreiche Labore haben gezeigt, dass eine breite Palette klinisch wirksamer Antidepressiva die Immobilitätsdauer verkürzt 9,20,21. Dieser unkomplizierte Test wird häufig für das Screening auf potenzielle antidepressive Substanzen verwendet und kann auch zur Charakterisierung des Phänotyps verschiedener Tierstämme sowie transgener Mäuse in Studien verwendet werden, die die neurobiologischen Grundlagen depressiver Zustände untersuchen 9,21. UBE3AmGenedel/+ Tiere waren signifikant länger immobil als ihre Kontroll-Wurfgeschwister, was auf ihr depressionsähnliches Verhalten hindeutet (Abbildung 2).
Abbildung 2: Immobilitätszeit im Heckaufhängungstest. UBE3AmGenedel/+ Tiere zeigten eine längere Immobilität während der Schwanzaufhängung. Eine bidirektionale ANOVA zeigte signifikante Haupteffekte, aber keine Signifikanz in der Genotyp/Geschlechts-Interaktion (Genotyp-Effekt: p < 0,001; Geschlechtseffekt: p < 0,001 ; Genotyp/Geschlechts-Interaktion: p > 0,5). Die im Boxplot dargestellten Daten zeigen den Medianwert, den Interquartilsabstand und den Wertebereich. Signifikante Post-hoc-Testergebnisse sind mit * gekennzeichnet. Die Daten für Kontrolltiere (weiblich n = 10, männlich n = 14) sind rot und Mutanten (weiblich n = 10, männlich n = 11) blau dargestellt. Diese Abbildung wurde von Syding et al.6 übernommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Rotarod und Ganganalyse
Die Geschichte der Rotarod-Tests in Modellen neuromotorischer Defizite reicht bis in die Mitte des 20. Jahrhunderts zurück 22. Der Rotarod wird verwendet, um das Gleichgewicht und die Bewegungskoordination der Tiere zu beurteilen, da sich ihre Beeinträchtigungen in einer deutlich kürzeren Latenz beim Fallen von der rotierenden Stange14 manifestieren. Wiederholte Tests auf dem Rotarod werden verwendet, um die motorischen Lernfähigkeiten von Tieren zu untersuchen. Die rasante Entwicklung moderner Geräte und digitaler Technologien hat eine automatisierte, präzise und unvoreingenommene Bewertung von Phänotypen des Bewegungsapparates von Nagetieren auf der Grundlage detaillierter Beschreibungen ihres Ganges ermöglicht23. Die automatisierte Ganganalyse ersetzte die Fußabdruckanalyse und ist auch empfindlicher gegenüber neuromuskulären Defiziten14,24,25. Veränderungen der räumlich-zeitlichen Charakteristika des Tiergangs sind spezifisch für die modellierte nosologische Einheit26,27,28. UBE3AmGenedel/+ Mutanten wiesen einen robusten Wechsel der Gangindizes auf (Abbildung 3A-G), was durch eine reduzierte Latenz beim Sturz aus dem Rotarod bestätigt wird (Abbildung 3H).
Abbildung 3: Detaillierte Ganganalyse und motorisches Lernen am Rotarod. (A-G) Die Gangindizes von UBE3AmGenedel/+ Tieren waren verändert. UBE3AmGenedel/+ Tiere hatten einen längeren Schwung (A) und Stand (B), was zu einer längeren Schrittdauer und -länge (C,D) führte. Die Vortriebsdauer (E) und die Verzögerung (F) der Hintergliedmaßen wurden ebenfalls erhöht. Die Analyse ergab auch eine größere Pfotenfläche im Spitzenstand (G). Weder die metrischen Parameter noch das Gewicht der Tiere unterschieden sich (Daten nicht gezeigt), was darauf hindeutet, dass die beobachteten Unterschiede nicht auf Unterschiede in der Tiergröße zurückzuführen sind. Eine Zwei-Wege-ANOVA mit wiederholten Messungen zeigte einen signifikanten Haupteffekt des Genotyps ohne signifikante Genotyp/Geschlechts-Interaktion ( Genotyp-Effekt: p < 0,001; Genotyp/Geschlechts-Interaktion: p > 0,2). (H) Die Ergebnisse der Rotarod-Leistung zeigen eine kürzere Latenz bis zum Sturz bei UBE3AmGenedel/+-Tieren. Eine Zwei-Wege-ANOVA mit wiederholten Messungen ergab signifikante Haupteffekte ohne signifikante Wechselwirkung (Genotyp-Effekt: p < 0,001; Geschlechts-Effekt: p < 0,01; Genotyp/ Geschlechts-Interaktion: p > 0,1). Die im Boxplot dargestellten Gangparameter zeigen den Medianwert, den Interquartilsabstand und den Wertebereich an. Signifikante Post-hoc-Testergebnisse sind mit * gekennzeichnet. Die Daten der Falllatenz werden in einem Liniendiagramm als Mittelwert ± SEM dargestellt, die Daten für Kontrolltiere (weiblich n = 10, männlich n = 14) in rot und Mutanten (weiblich n = 10, männlich n = 11) in blau. Diese Abbildung wurde von Syding et al.6 übernommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Nestlet-Schreddern - Nestbau
Der Nestlet-Zerkleinerungstest dient in erster Linie dazu, stereotypes Zwangsverhalten bei Mäusen zu erkennen29,30. Mäuse zeigen jedoch eine natürliche Tendenz, das vorhandene Material für den Bau ihres Nestes zu zerreißen. Die Unfähigkeit, ein Baumwollnest zu zerkleinern, wird daher als Indikator für sein Wohlbefinden verwendet, das durch eine neurologische Entwicklungsstörung beeinträchtigt wird16,31. Die UBE3AmGenedel/+-Tiere verwendeten signifikant weniger Material für den Bau ihrer Nester, und dieser Unterschied war besonders ausgeprägt zwischen transgenen Weibchen und ihren Kontroll-Artgenossen (Abbildung 4A).
Abbildung 4: Verwendung von Nestlet-Material für den Nestbau. UBE3AmGenedel/+ Tiere zerkleinerten weniger Baumwollmaterial als ihre Kontrollwurfgeschwister. Die Daten wurden in ausgerichtete Ränge umgewandelt, um die Normalitätsvoraussetzung zu erfüllen. Eine Varianzanalyse mit wiederholten Messungen ergab einen signifikanten Genotyp-Effekt ohne Signifikanz der Genotyp-Geschlechts-Interaktion (Genotyp-Effekt: p < 0,05; Genotyp/Geschlechts-Interaktion: p > 0,4). Die im Liniendiagramm dargestellten Daten zeigen den Mittelwert ± REM. Signifikante Post-hoc-Testergebnisse sind mit * gekennzeichnet. Die Daten für Kontrolltiere (weiblich n = 10, männlich n = 14) sind rot und Mutanten (weiblich n = 10, männlich n = 11) blau dargestellt. Diese Abbildung wurde von Syding et al.6 übernommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Zeitskala für Tests
Jede Gruppe (Kontroll- und Versuchsgruppe) wird an den gleichen Tagen den gleichen Tests unterzogen. Eine Pause von 1 Tag zwischen den Tests wird verwendet, um mögliche Verschleppungseffekte zu minimieren. Wenn möglich, werden Weibchen und Männchen an aufeinanderfolgenden Tagen getestet; Andernfalls werden die Weibchen nach dem Test der Männchen getestet (Abbildung 5)6.
Abbildung 5: Zeitskala für das Testen. UBE3AmGenedel/+ Tiere und ihre Kontrollen wurden in zwei Kohorten getestet. Die Testzeitskala für die erste Kohorte ist im oberen Bereich und für die zweite Kohorte im unteren Bereich dargestellt. Die Tage, an denen die Männchen getestet wurden, sind blau angegeben, während die Tage, an denen die Weibchen getestet wurden, grün markiert sind. Tage, an denen beide Geschlechter getestet wurden, sind gelb markiert. An den Wochenenden wurde nicht getestet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Die Zahlen wurden von Syding et al.6 in Übereinstimmung mit der MDPI-Lizenzrichtlinie übernommen.
AS-Modelle, die in verschiedenen murinen Stämmen erstellt wurden, werden in der Regel mit Tests des emotionalen Zustands, der motorischen Funktionen und der kognitiven Fähigkeiten von Tieren validiert, um den Vergleich mit menschlichen Symptomen zu erleichtern31,32. Ein motorisches Defizit in AS-Modellen ist der konsistenteste Befund in allen Laboren, gefolgt von einem unveränderten Emotionalitätszustand der Mutanten und Schwierigkeiten beim Nesterbau31,32,33. Im Gegensatz dazu ist die kognitive Beeinträchtigung entweder leicht oder fehlt 7,31,33. Die Diskrepanz im kognitiven Phänotyp scheint vom Alter der getesteten Tiere abzuhängen, wie Huang et al.7 zeigen. Daher wurde für diese Arbeit eine Reihe von Tests auf der Grundlage ihrer Reproduzierbarkeit sowie ihrer Alters- und Speziesunabhängigkeit ausgewählt, da vergleichbare Ergebnisse sowohl in Maus- als auch in Ratten-AS-Modellen beobachtet werden 6,31,32.
Kritisch sollte man bedenken, dass die wiederholte Versuchung von Tieren in verschiedenen Versuchsanordnungen eine sorgfältige Reihenfolge erfordert, beginnend mit den Tests, die am empfindlichsten auf vorherige Manipulation reagieren, und gleichzeitig mit minimalen Auswirkungen auf die folgenden Tests, wie z. B. die EPM- und OF-Tests34. Weitere Bedenken betreffen den Nestlet-Schreddertest, bei dem die Tiere in Einzelhaltung gehalten werden, was bekanntermaßen ein stressiger Zustand ist35. Die anschließende Bündelung von Männchen in einem gemeinsamen Käfig führt oft zu erhöhter Aggression aufgrund der Etablierung von Hierarchien. Somit sollte der Nestlet-Zerkleinerungstest den Testplan abschließen. Es ist auch eine gute Praxis, Männchen vor Weibchen zu testen, um zu vermeiden, dass das Verhalten der Männchen durch nachlaufende weibliche Riechspuren beeinflusst wird. Der Wechsel von Tieren, die zu verschiedenen Versuchsgruppen gehören, während der Versuche ist in der Verhaltensforschung von entscheidender Bedeutung, um die Auswirkungen unvorhersehbarer Faktoren auf das Verhalten der Tiere auszugleichen. Es ist bekannt, dass der Umgang mit Tieren vor der Testung im EPM ihre beobachtete Stressreaktion beeinflusst. Daher muss der Umfang der Handhabung für alle Tiere gleich sein36. Es ist auch sehr wichtig, die Haltungsbedingungen (einzeln vs. Gruppen), die Beleuchtung während des Versuchs, den Zeitpunkt des Tests und vor der Testerfahrung für jedes Tier aufrechtzuerhalten, da all diese Faktoren die Reaktion einer Maus im EPM- und OF-Test beeinflussen und die Ergebnisse verzerren können37.
Trotz der vorgestellten Tests, die zu etablierten Screening-Tools in der Arzneimittelentwicklung gehören, und der Phänotypisierung genetisch veränderter Mäuse, die laborübergreifend reproduzierbare Ergebnisse liefern, können einige Tests noch geringfügigen Modifikationen unterliegen. Da motorische Beeinträchtigungen das Hauptmerkmal des Phänotyps eines AS-Tiermodells sind, könnte der Rotarod-Test auf 1 Tag statt auf 5 aufeinanderfolgende Tage beschränkt werden. Zusätzlich könnten Parameter, die die Qualität eines gebauten Nestes beschreiben, in den Nestlet-Zerkleinerungstest38 einbezogen werden.
Eine deutliche Einschränkung der vorgestellten Ergebnisse ist die Mehrdeutigkeit ihrer Interpretation. Insbesondere das motorische Defizit von AS-Tieren kann Veränderungen bei bewegungsbasierten Aufgaben wie dem OF-Test und EPM erklären. Analog dazu kann eine verlängerte Immobilitätszeit im TST eine Folge der größeren körperlichen Ermüdung sein, die AS-Tiere während dieses anspruchsvollen Tests entwickeln, im Gegensatz zu depressivem Verhalten. Auch im Nestchen-Zerkleinerungstest kann der reduzierte Baumwollverbrauch eher auf den neuromuskulären Phänotyp als auf den Verlust des Nestbauinstinkts zurückzuführen sein. Die Interpretation von Schrittlängenänderungen ist nicht eindeutig, da in einigen Mausmodellen der Parkinson-Krankheit eine Verkürzung beobachtet wird, während bei alternden Mäusen eine Verlängerung beobachtet wird39,40. Wir glauben jedoch, dass eine Zunahme der Gesamtschrittlänge eine Folge einer längeren Schwungdauer ist. Die Schwungdauer nimmt mit den Schmerzen zu und verlängert sich in Arthritismodellen, was bedeutet, dass eine längere Schwungdauer bei Mäusen möglicherweise eine korrekte Positionierung der Gliedmaßen vor dem Tragen des Gewichts ermöglichen könnte41,42. Die Antriebsdauer bezieht sich auf die Zeitspanne, die ein Tier benötigt, um eine Vorwärtsbewegung zu initiieren und aufrechtzuerhalten. Daher kann eine kurze Dauer bei gesunden Tieren auf eine größere Kraft und eine bessere Kontrolle hindeuten. Diese Befunde charakterisieren nicht nur dieses AS-Mausmodell, sondern deuten auch auf eine Beeinträchtigung des Gangs hin. Um die physiologischen Grundlagen einer solchen Beeinträchtigung aufzuklären, sind jedoch genauere Untersuchungen erforderlich, wie z. B. die Bestimmung der Muskelkraft und die Untersuchung neuromuskulärer Verbindungen/Übertragungen.
Trotz des interpretatorischen Dilemmas liefert die vorgestellte Reihe von Verhaltenstests reproduzierbare Ergebnisse, die in allen Laboren konsistent sind, und kann als elegantes Validierungswerkzeug für neue murine Modelle des Angelman-Syndroms und neue therapeutische Ansätze dienen 6,31,32,43,44,45.
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Diese Forschung wurde von der Tschechischen Akademie der Wissenschaften RVO 68378050, LM2018126 Tschechischen Zentrum für Phänogenomik von MEYS CR, OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001789 (Upgrade des Tschechischen Zentrums für Phänogenomik: Entwicklung hin zur Translationsforschung durch MEYS und ESIF), OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015861 (CCP Infrastructure Upgrade II von MEYS und ESIF) und OP RDI CZ.1.05/2.1.00/19.0395 (höhere Qualität und Kapazität für transgene Modelle durch MEYS und EFRE) unterstützt. Darüber hinaus wurde diese Studie von der NGO "Association of Gene Therapy (ASGENT)", Tschechien (https://asgent.org/) und LM2023036 Tschechischen Zentrum für Phänogenomik finanziert, das vom Ministerium für Bildung, Jugend und Sport der Tschechischen Republik zur Verfügung gestellt wird.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cages, individually ventilated | Techniplast | ||
DigiGait | Mouse Specifics, Inc., 2 Central Street Level Unit 110 Framingham, MA 01701, USA | Equipment was tendered, no catalogue number was provided, nor could be find on company's web site | Detailed analysis of mouse gait, hardware and software provided. |
FDA Nestlet squares | Datesand Ltd., 7 Horsfield Way, Bredbury, Stockport SK6, UK | Material was bought from Velaz vendor via direct email request. Velaz do not provide any catalogue no. | Cotton nestlets for nest building test. Nestlet discription: 2-3 g each, with diameter around 5 x 5 x 0.5cm. |
Mouse chow | Altramion | ||
Rotarod | TSE Systems GmbH, Barbara-McClintock-Str.4 12489 Berlin, Germany | Equipment was tendered, no catalogue number was provided, nor could be find on company's web site | Rotarod for 5 mice, hardware and software provided. Drum dimensions: Diameter: 30 mm, width per lane: 50 mm, falling distance 147 mm. |
Tail Suspension Test | Bioseb, In Vivo Research Instruments, 13845 Vitrolles FRANCE | Reference: BIO-TST5 | Fully automated equipment for immobility time evaluation of 3 mice hanged by tail, hardware and software provided |
Transpore medical tape | Medical M, Ltd. | P-AIRO1291 | The tape used to attach an animal to the hook by its tail. |
Viewer - Video Tracking System | Biobserve GmbH, Wilhelmstr. 23 A 53111 Bonn, Germany | Equipment with software were tendered, no catalogue number was provided, nor could be find on company's web site | Software with custom made hardware: maze, IR base, IR sensitive cameras. Custom-made OF dimensions: 42 x 42 cm area, 49 cm high wall, central zone area: 39 cm2. A custom-made EPM was elevated 50 cm above the floor, with an open arm 79 cm long, 9 cm wide, and closed arm 77 cm long, 7.6 cm wide. |
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