Ein modifiziertes heterotopes Herztransplantationsprotokoll der Maus, das den heutigen Standards der aseptischen Technik, Anästhesie und Analgesie entspricht

Die vorliegende Arbeit beschreibt eine modifizierte Technik für die heterotope vaskularisierte Herztransplantation mit aktualisierter aseptischer Technik, Analgesie und Anästhesie.

Die Entwicklung experimenteller Modelle für die Herztransplantation bei Tieren hat zu vielen Fortschritten auf dem Gebiet der Immunologie und der Transplantation solider Organe beigetragen. Während das heterotope vaskularisierte Maus-Herztransplantationsmodell ursprünglich in Studien zur Transplantatabstoßung mit Kombinationen von nicht übereinstimmenden Inzucht-Mausstämmen verwendet wurde, kann der Zugang zu genetisch veränderten Stämmen und therapeutischen Modalitäten wichtige neue präklinische Erkenntnisse liefern. Grundsätzlich hat sich die chirurgische Methodik für diese Technik seit ihrer Entwicklung nicht geändert, insbesondere im Hinblick auf wichtige Faktoren wie aseptische Technik, Anästhesie und Analgesie, die wesentliche Auswirkungen auf die postoperative Morbidität und Mortalität haben. Darüber hinaus wird erwartet, dass Verbesserungen im perioperativen Management sowohl das Tierwohl als auch die Versuchsergebnisse verbessern werden. Dieser Artikel berichtet über ein Protokoll, das in Zusammenarbeit mit einem Fachexperten für Veterinäranästhesie entwickelt wurde, und beschreibt die Operationstechnik mit Schwerpunkt auf perioperativem Management. Darüber hinaus diskutieren wir die Auswirkungen dieser Verfeinerungen und geben Details zur Fehlerbehebung bei kritischen chirurgischen Schritten für dieses Verfahren.

Wir verdanken einen großen Teil unseres Verständnisses von Immunologie und Transplantation der Forschung, die auf experimentellen Modellen der Transplantation solider Organe an tierischen Probanden basiert. Seit der Erstbeschreibung der vaskularisierten Herztransplantation bei Säugetieren¹ haben solche Modelle zum Wissen in einer Vielzahl von Bereichen beigetragen, darunter die therapeutische Anwendung der Hypothermie², die Vorteile der Verwendung spezialisierter Nähte³ und Techniken für die Homotransplantation von Lunge und Herz⁴. Die Entwicklung von kardialen Transplantationsmodellen bei Ratten ^5,6 bot aufgrund der Verfügbarkeit verschiedener Zuchtlinien einen breiteren Spielraum für immunologische Experimente. Das wesentlich größere Spektrum an verfügbaren Inzucht- und mutierten Mausstämmen veranlasste Corry et ^al.7 dazu, eine Technik der heterotopen Herztransplantation von Mäusen zu entwickeln, da diese Bandbreite erhebliche Vorteile für die Transplantationsforschung mit sich bringt. Dieses Modell ist weit verbreitet und hat zu einem besseren Verständnis der Transplantatabstoßung⁸ und der Therapeutika⁹ beigetragen. Seit ihrer Erstbeschreibung ist die Technik jedoch weitgehend unverändert geblieben, abgesehen von einigen kleineren technischen Details, wie z. B. Anpassungen der Position der Anastomosenstellen^10,11.

Seit der Integration der Technik von Corry et ^al.7 in unsere Experimente haben wir vielversprechende Bereiche für die Verbesserung des Protokolls identifiziert, nämlich die der aseptischen Technik, der Anästhesie und der Analgesie. Es wurde erwartet, dass sich Verbesserungen in diesen Bereichen positiv auf die Versuchsergebnisse auswirken und den Tierschutz verbessern würden. Dies wurde bereits bei der Anwendung der aseptischen Technik in Kleintieroperationen gezeigt, da sie zur Reduzierung postoperativer Infektionen beiträgt¹², was sich nicht nur auf die Morbidität und Mortalität auswirkt, sondern auch Experimente zur Beurteilung der Immunantwort nach einer Transplantation beeinträchtigen kann. Aus Sicht der Anästhesie und Analgetika trägt die Verwendung eines verfeinerten Schemas dazu bei, die Kosten für die Tiere zu senken und das ethische Argument dieses chirurgischen Modells auszugleichen, indem die Schmerzen und das Leiden der Versuchspersonen gelindert werden. Darüber hinaus begrenzen eine angemessene Anästhesie und Analgesie die schmerzassoziierte Stressreaktion, was die Qualität der postoperativen Genesung verbessert und letztendlich die chirurgische Erfolgsrate erhöht¹³.

Mit dem Ziel, sowohl das Tierwohl als auch die Versuchsergebnisse zu verbessern, wurde ein Protokoll mit Anpassungen entwickelt, um diese Lücken zu schließen. Dieses Protokoll wurde von dem ursprünglich von Corry et ^al.7 beschriebenen Protokoll unter Konsultation eines tierärztlichen Anästhesisten und unter gebührender Berücksichtigung sowohl der Wirkungen als auch der Wirkungsdauer der pharmakologischen Interventionen, die im Anästhesie- und Analgetika-Regime verwendet werden, angepasst. Der Ansatz basierte auf den Prinzipien der ausgewogenen Anästhesie und der multimodalen Analgesie, um eine angemessene perioperative Versorgung zu gewährleisten¹⁴. Neben der Anwendung der aseptischen Technik wurden präventiv das Opioid Buprenorphin und das Lokalanästhetikum Bupivacain verabreicht. Die Vollnarkose wurde mit dem Inhalationsanästhetikum Isofluran durchgeführt.

Diese Forschung wurde in Übereinstimmung mit dem Verhaltenskodex für die Pflege und Verwendung von Tieren für wissenschaftliche Zwecke¹⁵ durchgeführt und gemäß den Tierethikprotokollen RA/3/100/1568 und AE173 genehmigt (Tierethikkommission der Universität von Westaustralien bzw. Tierethikausschuss des Harry Perkins Institute of Medical Research). In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu allen Materialien, Instrumenten und Tieren, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. Vorbereitung des Tieres für die Operation

HINWEIS: Das Personal ist entweder für die Durchführung von Operationen oder die Überwachung der Anästhesie während des gesamten Eingriffs zuständig.

1. Bei präoperativer Analgesie wird der Empfängermaus mindestens 1 Stunde vor Beginn der Empfängeroperation eine Dosis Buprenorphin (0,05-0,1 mg/kg, verdünnt auf 0,03 mg/ml mit Natriumchlorid 0,9 %) subkutan verabreicht. Tragen Sie alle Details zur Verabreichung von Medikamenten, deren Dosis, Zeitpunkt der Verabreichung und deren Wirkung in das Anästhesieprotokoll ein.
   HINWEIS: Dieser Ansatz ist für den Spender nicht unbedingt erforderlich, da es sich um eine Operation ohne Genesung handelt, bei der der Spender unmittelbar nach der Entnahme des Organs unter Vollnarkose eingeschläfert wird.
2. Einleitung der Anästhesie
   1. Legen Sie die Maus in die Induktionskammer des Anästhesie-Beatmungssystems mit einem Sauerstoffstrom von 1-2 L·min⁻¹ mit 4 % Isofluran. Bestätigen Sie eine adäquate Anästhesie, indem Sie das Liegen, den Verlust des Aufrichtungsreflexes und eine verminderte Atemfrequenz beobachten.
   2. Sobald die Maus ausreichend betäubt ist, nehmen Sie die Maus aus der Induktionskammer und rasieren Sie den ventralen Bauch mit einer Haarschneidemaschine, um die Haare zu entfernen. Rasieren Sie beim Spender den Bereich, der sich von den Genitalien bis zum oberen Rand des ventralen Thorax erstreckt. Rasieren Sie beim Empfänger den Bereich, der sich von den Genitalien bis zum Rippenrand erstreckt. Achten Sie in beiden Fällen darauf, dass der rasierte Bereich seitlich bis zur Mittelachsellinie reicht.
3. Um die Anästhesie aufrechtzuerhalten, positionieren Sie die Maus in dorsaler Liege, um Anästhetika und Sauerstoff aus dem Nasenkegel des Atemsystems zu erhalten (keine Rückatmung), der Sauerstoff mit einer Rate von 1 L·min⁻¹ und Isofluran (1,5%-2,5%) liefert.
   Anmerkungen: Die chirurgische Arbeitsfläche ist ein chirurgisches Brett über einem Heizkissen, und jedes Glied der Maus ist mit Mikroporenband gesichert.
4. Angesichts der Schwierigkeit, die physiologischen Veränderungen im Zusammenhang mit der Anästhesie bei Mäusen umfassend zu überwachen, sollten begrenzte Parameter überwacht und aufgezeichnet werden. Überwachen Sie die Temperatur, die Narkosetiefe und die Atemfrequenz mindestens alle 5 Minuten für die Dauer der Anästhesie.
   1. Um eine schwere Unterkühlung und Hyperthermie (durch aktive Erwärmung durch das Wärmekissen) zu vermeiden, überwachen Sie die Körpertemperatur während des gesamten Eingriffs. Führen Sie eine saubere, geschmierte Rektumsonde in das Rektum des Tieres ein und befestigen Sie sie dann mit Mikroporenband am Operationskarton.
      Anmerkungen: Diese Sonde wird an ein dynamisches System (eine Funktion des Anästhesieabgabesystems) zurückgemeldet, das die Temperatur des Heizkissens ändert, um die Körpertemperatur zu steuern.
   2. Lassen Sie die für die Anästhesie verantwortliche Person die Narkosetiefe beurteilen, indem sie die Reaktionen auf die Stimulation der Pfote oder des Schwanzes durch den Druck einer atraumatischen Pinzette, den Lidreflex und den Muskeltonus beobachtet.
   3. Messen Sie die Atemfrequenz, indem Sie die Bewegung der Brustwand beobachten, während Sie die Atemanstrengung subjektiv beobachten, um das Tidalvolumen zu beurteilen. Berechnen Sie die Atemfrequenz, indem Sie die Atemzüge über einen Zeitraum von 10-15 s zählen und mit 6 bzw. 4 multiplizieren, um eine Atemfrequenz/Minute zu bestimmen.
5. Um die Haut vorzubereiten, desinfizieren Sie die Operationsstelle mit sterilen Applikatoren mit Wattespitze. Tragen Sie Chlorhexidin in einer kreisförmigen, sich ausdehnenden Bewegung von der Mitte des Operationsfeldes bis zu den Rändern auf. Wiederholen Sie diesen Vorgang 3x (jedes Mal mit einem neuen Applikator mit Wattespitze), bevor Sie eine Kombination aus Chlorhexidin und Ethanol mit einem neuen sterilen Applikator mit Wattestäbchen im gleichen Muster auftragen, wobei Sie sich von der Mitte des Operationsfelds zum Rand bewegen.
6. Lassen Sie den Chirurgen ein Handgel auf Ethanolbasis auftragen, bevor Sie einen sterilen OP-Kittel und sterile OP-Handschuhe anziehen.
7. Um das Operationsfeld vorzubereiten, platzieren Sie sterile OP-Abdeckungen (vorgeschnitten auf 25 cm x 25 cm) auf beiden Seiten des Operationskartons, die als Stelle für die Platzierung steriler Instrumente dienen. Verwenden Sie eine sterile Schere, um ein breiteres steriles Tuch von 25 cm x 40 cm zu öffnen, um eine kleine (etwas länger als die Einschnittstelle) ovale Öffnung zu schneiden. Legen Sie dieses Tuch so über das Tier, dass sich die Fenster an der vorgeschlagenen Einschnittstelle befinden. Achten Sie darauf, dass die seitlichen Enden dieses dritten Tuchs die beiden kleineren Vorhänge auf beiden Seiten überlappen, um ein durchgehendes Operationsfeld zu schaffen.

2. Spender-Chirurgie

HINWEIS: In der ergänzenden Abbildung S1 finden Sie die wichtigsten Aspekte der Spenderchirurgie.

1. Führen Sie die Spenderoperation mit Hilfe eines chirurgischen binokularen Mikroskops durch. Verwenden Sie zunächst eine 8-fache Vergrößerung und führen Sie einen Hautschnitt in der ventralen Mittellinie mit einer chirurgischen Skalpellklinge (#23) durch. Stellen Sie sicher, dass sich der Schnitt vom kaudalen Ende des rasierten Bereichs bis zum Rippenrand erstreckt und an beiden Enden ein intakter Rand der präparierten Haut vorhanden ist.
   HINWEIS: Die Anfangsvergrößerung von 8x wird gewählt, um eine ausreichende Visualisierung der Makrostruktur des Probanden zu Beginn der Operation zu ermöglichen. Von diesem Zeitpunkt an liegt die Vergrößerung im Ermessen des Bedieners und sollte so gewählt werden, dass ein angemessenes Gleichgewicht zwischen dem Situationsbewusstsein bei geringerer Vergrößerung und den feinen Details, die mit einer höheren Vergrößerung visualisiert werden können, gewährleistet ist.
2. Verschieben Sie den Dünndarm mit zwei sterilen Applikatoren mit Wattespitze, die mit erwärmter normaler Kochsalzlösung angefeuchtet sind, um die Bauchschlagader und die untere Hohlvene (IVC) freizulegen. Verwenden Sie die Applikatoren, um diese Gefäße stumpf vom umgebenden Gewebe zu trennen.
3. Verwenden Sie eine 3,0-ml-Spritze mit einer 30-g-Nadel (0,5 in), um 2,5 ml 100 I.E.L⁻¹ heparinisierte Natriumchlorid-Lösung mit 0,9 % zu entnehmen (bei 4 °C gehalten, bis sie während der Operation benötigt wird). Mit einer Nahzange mit gerader Spitze und runder Hand zur Fixierung der Bauchschlagader im infrazwerchfellatischen Bereich wird mit der dominanten Hand 1,5 ml Lösung in Richtung Herz in die Aorta injiziert. Versiegeln Sie die resultierende Aortotomie mit dem Druck eines Applikators mit Wattespitze.
4. Verwenden Sie eine mikrochirurgische Schere mit gerader Spitze, um die IVC zu durchtrennen, um eine Ausblutung zu ermöglichen.
5. Führen Sie eine Thorakotomie mit einer chirurgischen Schere durch, um zwei Schnitte in den beidseitigen Mittelachsellinien zu machen. Bestätigen Sie zu diesem Zeitpunkt den Tod des Tieres und schalten Sie den Isofluran-Verdampfer aus.
6. Befestigen Sie das resultierende Mittelsegment der Brustwand mit einer Mikro-Bulldoggenklemme. Geben Sie dies an den unsterilen chirurgischen Assistenten weiter, der dies mit Mikroporen-OP-Klebeband am Nasenkegel befestigen kann.
   HINWEIS: Das Ziel ist es, Traktion auf diesem Segment des Brustkorbs bereitzustellen, was bei der Freilegung des Herzgewebes hilft.
7. Mit einer Rundkörpernahzange wird die intrathorakale IVC identifiziert und mobilisiert.
   HINWEIS: Idealerweise sollte sich die Pinzette mit gerader Spitze in der nicht dominanten Hand und die gebogene Pinzette in der dominanten Hand befinden.
8. Wenn das IVC in der Pinzette der nicht dominanten Hand befestigt ist, injizieren Sie mit der dominanten Hand die restlichen 1,5 ml 100 I.E.L⁻¹ heparinisierte Natriumchloridlösung 0,9 % in das Herz.
9. Ligieren Sie die IVC mit beiden Pinzettensätzen mit 7/0 geflochtener Seide von 2 cm Länge. Verwenden Sie ein Instrument, um den Chirurgenknoten mit zwei zusätzlichen Würfen zur Sicherheit zu binden. Machen Sie diesen Knoten so proximal wie möglich entlang des Gefäßes zum Herzen.
10. Befestigen Sie die beiden Enden dieses Knotens mit einer Arterienzange. Positionieren Sie diese Pinzetten so, dass sie eine sanfte Traktion des Herzens in kaudaler Richtung ermöglichen, um eine optimale Gefäßpositionierung für die anschließende Dissektion zu ermöglichen.
11. Identifiziere den Thymus an der anterosuperioren Seite des Herzens. Verwenden Sie eine Pinzette, um dieses Organ vom Spender zu sezieren und die obere Hohlvene (SVC) zu identifizieren.
12. Entfernen Sie die Adventitia und das zugehörige Gewebe des SVC mit einer Pinzette. Verwenden Sie eine gebogene Pinzette, um stumpf zu sezieren und einen kleinen Kanal hinter dem Gefäß zu machen. Achten Sie darauf, dass dieser Kanal so nah wie möglich am Herzen liegt.
13. Führen Sie ein Stück 7/0 geflochtene Seide von 2 cm Länge mit einer Pinzette durch diesen Kanal und binden Sie es dann mit der oben genannten Technik.
14. An einer Stelle, die ca. 2 mm von dieser Ligatur entfernt ist (auf der dem Herzen gegenüberliegenden Seite), wird die SVC mit einer gebogenen mikrochirurgischen Schere geteilt.
15. Drehen Sie das Herz mit Applikatoren mit Wattestäbchen anatomisch nach rechts.
16. Identifizieren Sie die azygote Vene auf der anatomischen linken Seite des Herzens. Sezieren Sie es mit einer Pinzette stumpf von den umgebenden Strukturen. Verwenden Sie wie zuvor eine Pinzette mit gebogener Spitze, um einen kleinen Kanal hinter diesem Gefäß zu schaffen.
17. Verwenden Sie ein drittes Stück 7/0 geflochtene Seide, das auf 2 cm zugeschnitten ist, um die azygote Vene in maximaler Nähe des Herzens mit der gleichen Knotentechnik zu ligieren. Schneiden Sie das Gefäß 2 mm von der Ligatur auf der herzabgewandten Seite ab.
18. Drehen Sie den Scheitelpunkt des Herzens mit Watteapplikatoren wieder nach links. Verwenden Sie eine Pinzette, um die aufsteigende Aorta zu identifizieren und zu mobilisieren. Führen Sie die gebogene Pinzette unter den Aortenbogen, um einen Kanal zwischen der aufsteigenden und absteigenden Aorta zu schaffen.
19. Durchtrennen Sie den Aortenbogen mit einer mikrochirurgischen Schere mit gerader Spitze proximal zu seinen Ästen.
20. Identifizieren und mobilisieren Sie die Pulmonalarterie mit einer Pinzette. Machen Sie mit einer gebogenen Pinzette einen Kanal hinter dem Gefäß.
21. Durchtrennen Sie die Arterie mit einer mikrochirurgischen Schere mit gerader Spitze an einem Punkt, der sich gerade in der Nähe ihrer Bifurkation befindet.
22. Injizieren Sie mit einer Rycroft-Spülkanüle vorsichtig 2 ml 10 IU·ml⁻¹ heparinisiertes Natriumchlorid 0,9 % durch die Pulmonalarterie und die aufsteigende Aorta, um das restliche Blut aus dem Herzen zu spülen.
    HINWEIS: Eine ausreichende Spülung wird durch die Entfernung von sichtbarem Blut aus den Herzkranzgefäßen angezeigt.
23. Mit einem 3 cm langen Stück geflochtener Seide 7/0 die restlichen hinteren Gefäße (die Lungenvenen) mit einem Chirurgenknoten en bloc mit zwei aufeinanderfolgenden Würfen ligieren. Trennen Sie das Herz von der hinteren Brustwand, indem Sie vorsichtig mit einer chirurgischen Schere schneiden.
24. Entfernen Sie das Herz vorsichtig aus dem Brustkorb, tauchen Sie es in University of Wisconsin Solution (UWS) und legen Sie es dann zur Lagerung auf Eis (bei 4 °C).

3. Empfänger-Operation

1. Nach der Vorbereitung des Tieres, wie in Abschnitt 1. beschrieben, Augengleitmittel auftragen. Injizieren Sie eine gewichtsabhängige Dosis (8 mg/kg) Bupivacain (0,25 % verdünnt auf 0,625 mg/ml in 0,9%iger Natriumchloridlösung) in das subkutane Gewebe des ventralen Abdomens entlang der geplanten Inzisionsstelle. Verwenden Sie für diese Injektion eine 29-g-Insulinspritze und achten Sie auf eine gerade Linie sichtbarer Blasen, die das Ausmaß des geplanten Einschnitts abdeckt (ergänzende Abbildung S2A-C).
   Anmerkungen: Es sollten fünf bis sieben Minuten Zeit eingeräumt werden, um Zeit für die maximale Wirkung des Lokalanästhetikums zu haben.
2. Wenn das Mikroskop auf 8-fache Vergrößerung eingestellt ist, machen Sie mit einer sterilen chirurgischen Skalpellklinge (#23) einen Hautschnitt in der ventralen Mittellinie. Achten Sie darauf, dass sich die Laparotomie vom Unterbauch bis zum Rippenrand erstreckt. Setzen Sie einen Retraktor ein, um das Operationsfeld zu maximieren (ergänzende Abbildung S2D).
3. Befeuchten Sie ein 5 cm x 5 cm großes Segment steriler Gaze mit erwärmter 0,9%iger Natriumchloridlösung und positionieren Sie es an der oberen Seite der Operationsstelle. Nehmen Sie den Darm mit angefeuchteten, sterilen Wattestäbchen vorsichtig aus, positionieren Sie ihn auf dieser Gaze und wickeln Sie die Gaze um das Organ (ergänzende Abbildung S3A).
   HINWEIS: Dieses Verfahren trägt dazu bei, den unempfindlichen Flüssigkeitsverlust während der Operation zu reduzieren und die Retraktion zu unterstützen.
4. Befreien und mobilisieren Sie die Bauchschlagader und die IVC vom umliegenden Gewebe mit einer stumpfen Dissektionstechnik. Verwenden Sie für diesen Schritt eine Kombination aus Applikatoren mit Wattespitze und einer Rundkörper-Nahtzange. Stellen Sie sicher, dass sich der Abstandsbereich zwischen der infrarenalen Seite der Gefäße und knapp über der Bifurkation der Aorta befindet (ergänzende Abbildung S3B).
   HINWEIS: Eine geeignete Visualisierung an dieser Stelle erleichtert eine qualitativ hochwertige vaskuläre Anastomose.
5. Identifiziere die hinteren Bauchgefäße. Ziehen Sie die Aorta mit einer Pinzette sanft in eine von der Wirbelsäule abgewandte Richtung (d. h. längs zur Achse der Bauchgefäße).
   HINWEIS: Es ist wichtig, dass nur die Aorta und nicht die IVC aufgrund der Brüchigkeit der letzteren auf diese Weise behandelt wird.
6. Ligate jedes Bauchgefäß, das in der geplanten Anastomosenzone identifiziert wurde. Machen Sie auf beiden Seiten dieser Gefäße einen Kanal cephalocaudal, indem Sie die gekrümmte Pinzette hinter den Bauchgefäßen auf beiden Seiten führen. Jedes auf diese Weise identifizierte und mobilisierte Gefäß mit Längen von 10/0 Nylon, die mit Instrumenten zu Chirurgenknoten mit einem zusätzlichen Wurf zusammengebunden wurden (ergänzende Abbildung S3C).
7. Isolieren Sie die Anastomosenstelle vom Blutkreislauf. Setzen Sie dazu eine chirurgische Klemme sowohl am Kopf als auch an den kaudalen Enden der Bauchgefäße ein (wichtig in genau dieser Reihenfolge). Stellen Sie sicher, dass die Klemmen beide Gefäße in ausreichendem Maße kreuzen, um einen vollständigen Verschluss zu gewährleisten.
8. Führen Sie mit einer Pinzette in der nicht dominanten Hand zur Stabilisierung der Aorta eine Aortotomie mit einer 30-G-Nadel an der vorderen Seite der Aorta durch. Verlängern Sie es mit einer mikrochirurgischen Schere mit gerader Spitze (ergänzende Abbildung S3D).
9. Führe eine Venotomie durch. Üben Sie mit einer geraden Pinzette eine sanfte anteriore Traktion auf die IVC an der Stelle aus, die mit der Mitte der Aortotomie übereinstimmt. Verwenden Sie eine gebogene mikrochirurgische Schere, bei der die konkave Seite nach vorne zeigt, um ein IVC-Segment von gleicher Länge wie die Aortotomie zu entfernen (ergänzende Abbildung S4A).
10. Waschen Sie mit 10 ^I.E.L−1 heparinisierter Natriumchloridlösung das Innere der geöffneten Gefäße von verbleibendem Blut.
11. Legen Sie das Spenderherz in den Bauch. Achten Sie darauf, dass die aufsteigende Aorta direkt neben der abdominalen Aortotomie liegt und das Herz gedreht ist, damit die Pulmonalarterie für die zweite Anastomose quergezogen werden kann.
12. Platzieren Sie mit 10/0-Nylon eine Stay-Naht zwischen der 12-Uhr-Position der Aortotomie und dem entsprechenden Ende des Lumens der aufsteigenden Aorta. Führen Sie dies mit einer Pinzette mit gerader Spitze und einem mikrochirurgischen Nadelhalter durch und binden Sie ihn mit einem Chirurgenknoten mit drei aufeinanderfolgenden Würfen. Schneiden Sie die Enden so ab, dass ca. 2 mm Naht übrig bleiben.
13. Platzieren Sie eine zweite Stay-Naht zwischen der 6-Uhr-Position der Aortotomie und dem entsprechenden Aspekt der aufsteigenden Aorta. Da diese Naht auch als Basis für nachfolgende laufende Nähte dient, lassen Sie mindestens 10 mm des Schwanzes für die endgültige Abbindung übrig.
14. Platzieren Sie eine durchgehend verlaufende Naht aus 10/0 Nylon aufsteigend, um den anatomisch rechten Rand der Aortotomie und den entsprechenden freien Rand der aufsteigenden Aorta entgegenzusetzen. Verwenden Sie ungefähr vier Würfe für diese Linie.
15. Führen Sie das freie Ende der Naht um die distale Stegnaht herum, bevor Sie eine zweite durchgehend verlaufende Naht entlang der anatomisch linken Seite platzieren, um die Apposition mit der verbleibenden freien Kante der Aortotomie zu beeinflussen. Binden Sie die Naht mit einem Chirurgenknoten mit zwei zusätzlichen Würfen am Schwanz ab.
16. Platzieren Sie eine Stay-Naht zwischen der 12-Uhr-Position der IVC-Venotomie und dem entsprechenden Ende des Lumens der Pulmonalarterie.
17. Von diesem Ankerpunkt aus wird eine durchgehend verlaufende Naht absteigend zwischen dem anatomisch linken Rand der Pulmonalarterie und dem entsprechenden Rand der Venotomie platziert. Verwenden Sie durchschnittlich vier Würfe für diese Linie, gefolgt von einem zwischen der 6-Uhr-Position der Venotomie und dem entsprechenden Ende des Lumens der Pulmonalarterie. Mache vier weitere Würfe, um die letzten freien Ränder der Pulmonalarterie und der Venotomie zusammenzuzeichnen.
18. Binden Sie das freie Ende der Naht mit einem Instrument am Ankerende ab und binden Sie den Chirurgenknoten mit zwei zusätzlichen Würfen.
19. Positionieren Sie das Herz mit Wattestäbchen so, dass es mittig im Bauch sitzt. Überprüfen Sie die Gefäße auf Verdrehungen, die den Blutfluss beeinträchtigen würden.
20. Positionieren Sie den Gelschaum über allen Nahtlinien (ergänzende Abbildung S4B). Legen und formen Sie zwei Stücke von jeweils ca. 2 mm so um sie herum, dass alle sichtbaren Nahtlinien abgedeckt sind.
21. Lösen Sie die Gefäßklemmen: zuerst die Schwanzklemme und dann die Cephaloklemme. Da mit einer geringen Blutung zu rechnen ist, positionieren Sie präventiv Applikatoren mit Wattestäbchen über den Anastomosenstellen, um Druck auszuüben.
22. Sobald das Herz frei von beobachtbaren Leckagen ist, wird es auf Pulsation untersucht (ergänzende Abbildung S4C). Wenn dies nicht der Fall ist, stellen Sie sicher, dass keine Verdrehung der Herzgefäße aufgetreten ist (insbesondere bei der IVC).
23. Positionieren Sie den Darm nun über und um das Herz herum. Wenn sie trocken erscheint, befeuchten Sie die Peritonealhöhle mit erwärmter Natriumchloridlösung.
24. Verschließen Sie die Bauchhöhle mit nicht resorbierbarem 6/0 Prolen-Monofilament schichtweise:
    zuerst die Muskelschicht und dann die Haut (ergänzende Abbildung S4D). Verwenden Sie die kontinuierliche, nicht unterbrochene Technik.
25. Nehmen Sie den Empfänger vorsichtig aus dem OP-Board und nehmen Sie ihn aus dem Anästhetikum.
26. Verabreichen Sie 1 ml warme Kochsalzlösung subkutan und legen Sie den Empfänger in einen vorbereiteten Käfig mit Erwärmung zur Beobachtung gemäß den postoperativen Genesungsprotokollen (ergänzende Abbildung S4E).

4. Nachsorge

1. Legen Sie den Empfänger unmittelbar nach der Operation für mindestens 3 Stunden in einen sauberen Käfig auf einem Heizkissen unter genauer Beobachtung. Überwachen Sie während dieser Zeit mindestens alle 30 Minuten verschiedene Parameter (Aktivität, Körperhaltung, Fellzustand, Gesichtsausdruck, Gang, Belüftung, Aussehen der Operationsstelle, Vorhandensein eines tastbaren Bauchherzschlags). Weisen Sie jedem Parameter eine Punktzahl zu (0 = normal, 1 = leicht oder zeitweise abnormal, 2 = mäßig oder durchgehend abnormal).
   HINWEIS: Die Interventionen werden durch die Summe der überwachten Parameter ausgelöst, die die im Ethikprotokoll für dieses Modell festgelegten Wohlfahrtswerte überschreiten.
2. Bringen Sie die Empfänger in einen erwärmten Schrank, der bei 25 °C aufbewahrt wird, wo sie bis zum 7. Tag nach der Operation bleiben. Überwachen Sie sie in den ersten 3 Tagen mindestens 2x täglich. Überwachen Sie sie in den verbleibenden 4 Tagen mindestens 1x täglich. Bei postoperativer Analgesie wird der Empfängermaus am Abend nach der Operation eine Dosis Buprenorphin (0,5-0,1 mg/kg, verdünnt auf 0,03 mg/ml mit Natriumchlorid 0,9%) subkutan und in den nächsten 3 postoperativen Tagen zweimal täglich verabreicht.
3. Nach der Entnahme aus dem erwärmten Schrank sind die Empfänger mindestens 2x wöchentlich bis zum entsprechenden experimentellen Endpunkt zu überwachen.

Um die Wirksamkeit der Operationstechnik bei der Förderung guter Ergebnisse der Wundheilung und der Genesung der Maus zu bestimmen, wurden in frühen Experimenten im Labor die Überlebenseigenschaften einer Reihe von Herztransplantaten mit unterschiedlicher Immunogenität für den Empfänger bestimmt. Dazu gehörten kongene (n = 5) und syngene (n = 5) Transplantate, die die gleichen MHC-Marker (Major Histocompatibility Complex) wie der Empfänger aufweisen, und Major Mismatch-Transplantate (n = 9), bei denen das Transplantat und der Empfänger unterschiedliche MHC-Marker aufweisen. Wir nutzten die direkte Palpation des heterotopen abdominalen Herzschlags, um die laufende Transplantatfunktion und Lebensfähigkeit zu beurteilen, die als Proxy-Marker für Abstoßung versus Toleranz dient.

In beiden Kontrollgruppen waren alle Transplantate zum experimentellen Endpunkt von 100 Tagen lebensfähig (Mittelwert undefiniert). Die nicht übereinstimmende Gruppe hatte eine durchschnittliche Überlebenszeit von 9 Tagen. Abbildung 1 zeigt Kaplan-Meier-Überlebenskurven, die den starken Kontrast beim Transplantatüberleben zwischen nicht übereinstimmenden und Kontrollherztransplantaten demonstrieren¹⁶. Diese Daten deuten darauf hin, dass die Technik ausreicht, um eine angemessene Heilungsreaktion nach dem Eingriff zu fördern. Bei Vorliegen einer pathologischen Entzündung, die in diesem Fall durch eine Transplantatabstoßung im Mismatch-Zustand dargestellt wird, führt die Gewebezerstörung jedoch zu einem schnellen Funktionsverlust.

Abbildung 1: Der Einfluss von Mismatch auf das Überleben orthotoper Herztransplantationen. Überlebenskurven, die die vollständige Genesung und Akzeptanz von syngenen (n = 5) und kongenen (n = 5) heterotopen murinen Herztransplantationen für mindestens 100 Tage nach der Operation veranschaulichen, im Gegensatz zur raschen Abstoßung größerer nicht übereinstimmender (n = 7) heterotoper Mausherztransplantationen bereits am 7. Tag nach der Operation. Diese Daten wurden in Prosser et ^al.16 veröffentlicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Tabelle 1: Bereich der warmen und kalten Ischämiezeiten für Spender- und Empfängeroperationen im Zusammenhang mit der orthotopen Herztransplantation.

Ergänzende Abbildung S1: Schwerpunkte der Spenderchirurgie. (A) Isofluran-Anästhesie; (B) Heparin-Injektion; (C) freigelegtes Spenderherz; (D) Spülung des Herzens mit heparinisierter Kochsalzlösung; (E) Anbinden des Schiffes; (F) Spenderherz für die Lagerung von kalter Ischämie. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S2: Wesentliche Aspekte der Operationsvorbereitung und Kauterisation von geschnittenen Hautgefäßen beim Empfänger. (A) Vorbereitung der Operationsstelle des Empfängers; (B) Bupivacain-Injektion; (C) sterile chirurgische Abdeckung der Operationsstelle; (D) Kauterisation der geschnittenen Hautgefäße. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S3: Schlüsselaspekte der Empfängerchirurgie – von der Repositionierung des Darms bis zur Aortotomie. (A) Vorübergehende Umlagerung des Darms; (B) untere Hohlvene freigelegt und geklemmt; (C) Platzieren der Strebennaht; (D) erste Phase: Aortotomie. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S4: Schlüsselaspekte der Empfängeroperation – von der Venotomie bis zur Genesung. (A) Zweite Phase: Venotomie; (B) Platzieren des Gelschaums; (C) Reperfusion; (D) chirurgischer Verschluss; (E) Wiederherstellung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Das orthotope Herztransplantationsmodell der Maus ist ein robustes präklinisches Modell, das in erster Linie verwendet wird, um die Auswirkungen einer MHC-Fehlanpassung auf das Ausmaß und die Art der immunologischen Abstoßung und in jüngerer Zeit die Auswirkungen der Transplantation auf den Erhalt der im Transplantatgewebe ansässigen Immunität zu untersuchen¹⁶. Während wir uns zunächst eng an das Protokoll von Corry et ^al.7 hielten, haben wir das Protokoll verfeinert, um Best-Practice-Standards für aseptische Technik, Analgesie und Anästhesie zu integrieren. Die Aktualisierung dieser neuen Praktiken wurde durch zusätzliche Schulungen, die Bereitstellung steriler OP-Handschuhe, -Kittel und OP-Abdeckungen, die Anwendung zusätzlicher Anästhesie und die Aktualisierung der Analgesiedosierung erreicht. Solche Änderungen führten zu einer geringfügigen Verlängerung der chirurgischen Einrichtungszeit und zu zusätzlichen Kosten pro Operation.

Die Verwendung von Tieren zur Lösung wichtiger Forschungsanliegen ist im Rahmen eines Vertrags zwischen Forschern und einer Tierethikkommission (AEC) erlaubt, um eine soziale Lizenz zur Durchführung solcher Arbeiten aufrechtzuerhalten. Die Entscheidungen einer AEC basieren auf klaren ethischen Richtlinien¹⁵ mit dem übergeordneten Prinzip, die Kosten für das Tier gegen den Nutzen für die Gesellschaft abzuwägen. Das Konzept der drei Rs (Reduction, Replacement, Refinement) ist von entscheidender Bedeutung, wenn es darum geht, wie die Kosten eines Projekts gemindert werden.

Die Minimierung des Schadens für die betroffenen Tiere durch die Einführung artgerechter, perioperativer Analgesie und Anästhesie spielt in Tiermodellen der Chirurgie eine unersetzliche Rolle und ist ein Beispiel für Verfeinerung. Darüber hinaus haben Pflege und Techniken, die das Risiko von umweltbedingten und verhaltensbedingten Infektionsvektoren für den chirurgischen Empfänger verringern, positive Auswirkungen sowohl auf die Verringerung des Schadens für das Tier in Bezug auf Morbidität und Mortalität als auch auf die Minimierung der finanziellen Kosten, die mit der Wiederholung fehlgeschlagener Operationen verbunden sind. Obwohl die Sauberkeit des Versuchstier-"Operationssaals" nicht annähernd an die eines Krankenhausäquivalents heranreicht, sollte sie bei solchen Arbeiten kein nachträglicher Gedanke sein.

Aus wissenschaftlicher Sicht beeinflussen postoperative Infektionen zwangsläufig das Profil von inflammatorischen Zytokinen und Immunzellen, die die typischen Messwerte für Experimente zur Beurteilung der Genesung oder Abstoßung von Transplantaten sind. Es sollten daher maximale Anstrengungen unternommen werden, um postoperative Infektionen zu kontrollieren, da dies negative Auswirkungen auf die Aussagekraft der Forschung haben kann. Der Fokus auf die Analgesie ist aus Sicht des Tierschutzes wichtig. Tiertransplantationen sind große Eingriffe, und es sollten große Anstrengungen unternommen werden, um unnötige Schmerzen und Leiden der Probanden zu reduzieren. Um auf die praktischen Ergebnisse dieses Schwerpunkts zurückzukommen: Ein zusätzlicher praktischer Vorteil einer effektiven Schmerzkontrolle ist die geringere Wahrscheinlichkeit, dass Tiere aufgrund schmerzassoziierter Anzeichen von Stress aus dem Versuchsprotokoll entfernt werden.

Seit der ersten Beschreibung dieses Verfahrens haben mehrere Autoren über die Fehlerbehebung bei häufigen Problemen berichtet, die während des Verfahrens auftreten^10,11. Die Kontrolle von Blutungen nach dem Lösen der Klammern ist gut beschrieben und spiegelt Techniken wider, die in menschlichen Operationen verwendet werden, nämlich die Anwendung von Druck auf die Blutungsstelle, weitere Nähte und hämostatische Mittel. Wir haben festgestellt, dass Blutungen oft von einer von zwei Hauptstellen aus auftreten: den Anastomosestellen oder der Schädigung des Myokards. Ansätze zur Stillung der Herzblutung wurden von Niimi¹⁰ berichtet, die die Blutung aus dem Herzen durch Ligatur des Vorhofs kontrollierten. Unserer Erfahrung nach ist die Eindämmung des Blutflusses aus dem Myokard selbst aufgrund seiner reichhaltigen Vaskularisierung eine außergewöhnliche Herausforderung.

Es muss daher die gebotene Vorsicht walten lassen, um solche Verletzungen zu vermeiden, die am häufigsten durch eine falsch kontrollierte Pinzettenspitze verursacht werden, die während der Operation mit dem Herzmuskel in Berührung kommt. Wir versuchen daher, den Herzmuskel immer nur mit angefeuchteten Applikatoren mit Wattespitze direkt zu kontaktieren. Um den direkten Kontakt bei der Manipulation des Herzens zu reduzieren, können die freien Enden der endgültigen Seidenligatur verwendet werden, um das Herz zu bewegen, z. B. wenn es von UWS in die Brusthöhle bewegt wird.

Eine zweite große Herausforderung ist die Prävention der postoperativen Lähmung der Hintergliedmaßen, einer Komplikation, die Sterbehilfe erfordert. Anekdotisch haben wir herausgefunden, dass eine warme ischämische Zeit von >30 Minuten mit einem höheren Risiko für das Auftreten dieser Lähmung verbunden ist. Unsere ischämischen Zeiten werden streng überwacht und als informeller Leistungsstandard aufgezeichnet. Es sollte jedoch beachtet werden, dass die ischämische Zeit diese Komplikation nicht zuverlässig vorherzusagen scheint. Niimi¹⁰ zum Beispiel, ein Chirurg mit umfangreicher operativer Erfahrung (über 3.000 Operationen), berichtete, dass ischämische Zeiten von bis zu 2 Stunden akzeptabel sind.

Vielleicht noch verblüffender als das, Abbott et ^al.5, die eine ähnliche Technik bei Ratten entwickelten, aber eine End-to-End-Anastomose im Abdomen verwendeten (d. h. die IVC und die Bauchaorta wurden dauerhaft ligiert), berichteten von zwei Ratten, die als Langzeitüberlebende über 100 Tage ohne offensichtliche negative Auswirkungen gehalten wurden. Diese Unterschiede in den Ergebnissen zwischen den Gruppen lassen sich vielleicht durch subtil unterschiedliche Techniken oder alternativ durch die genetischen Unterschiede zwischen verschiedenen Mäusestämmen erklären. Zum Beispiel stellen wir fest, dass Ly5.1-Mäuse viel anfälliger für diese Komplikation sind als BALB/c-Mäuse. Um die Auswirkungen der ischämischen Zeit auf die Inzidenz von Lähmungen der Hintergliedmaßen zu verbessern, konnte der Einfluss der Dauer der abdominalen Gefäßverschlüsse untersucht werden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses beschriebene Protokoll einfache Verfeinerungen etablierter Techniken unter Verwendung leicht verfügbarer Medikamente und Materialien bietet. Diese Verfeinerungen bringen den Standard, nach dem dieses chirurgische Modell durchgeführt wird, an die Standards der klinischen Veterinärmedizin an und kommen den Tieren und letztlich der Forschung zugute.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Die Autoren bedanken sich bei den hervorragenden Bemühungen der Tierpfleger der University of Western Australia und des Harry Perkins Institute of Medical Research, die mit ihrem Engagement und ihrer Expertise zur Durchführbarkeit und zum Erfolg dieser Operationen beigetragen haben.