Uracil-DNA-Glykosylase-Assay durch matrixgestützte Laserdesorption/Ionisations-Time-of-Flight-Massenspektrometrie-Analyse

Eine nicht markierte, nicht-radioisotopische Methode zur Bestimmung der Uracil-DNA-Glykosylase-Aktivität wurde unter Verwendung der MALDI-TOF-Massenspektrometrie für die direkte apurinische/apyrimidinische standorthaltige Produktanalyse entwickelt. Der Assay erwies sich als ziemlich einfach, spezifisch, schnell und leicht zu bedienen für die DNA-Glykosylase-Messung.

Uracil-DNA-Glykosylase (UDG) ist eine Schlüsselkomponente im Reparaturweg der Basenexzision zur Korrektur von Uracil, das durch hydrolytische Desaminierung von Cytosin gebildet wird. Daher ist es entscheidend für die Aufrechterhaltung der Genomintegrität. Zur Messung der UDG-Aktivität wurde eine hochspezifische, nicht markierte, nicht-radioisotopische Methode entwickelt. Ein synthetisches DNA-Duplex, das ein ortsspezifisches Uracil enthielt, wurde von UDG gespalten und dann einer matrixgestützten Laserdesorption/Ionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie-Analyse (MALDI-TOF MS) unterzogen. Es wurde ein Protokoll erstellt, um das Produkt der apurinischen / apyrimidinischen Stelle (AP) in der DNA ohne Strangbruch zu erhalten. Die Änderung des m/z-Wertes vom Substrat zum Produkt wurde genutzt, um die Uracilhydrolyse mittels UDG zu bewerten. Für die kinetische UDG-Analyse wurde ein G:U-Substrat verwendet, das Km = 50 nM, _Vmax = 0,98 nM/s und Kcat = 9,31 ^s-1 ergibt. Die Anwendung dieser Methode auf einen Uracil-Glykosylase-Inhibitor (UGI)-Assay ergab einen _IC50-Wert von 7,6 pM. Die UDG-Spezifität unter Verwendung von Uracil an verschiedenen Positionen innerhalb von einzelsträngigen und doppelsträngigen DNA-Substraten zeigte unterschiedliche Spaltungseffizienzen. Somit könnte diese einfache, schnelle und vielseitige MALDI-TOF MS-Methode eine ausgezeichnete Referenzmethode für verschiedene monofunktionelle DNA-Glykosylasen sein. Es hat auch das Potenzial als Werkzeug für das DNA-Glykosylase-Inhibitor-Screening.

Obwohl Uracil eine normale Base in RNA ist, ist es eine häufige und hochgradig mutagene Läsion in der genomischen DNA. Uracil kann durch spontane/enzymatische hydrolytische Desaminierung eines Desoxycytidins entstehen. In jeder lebenden Zelle tritt diese Desaminierung 100-500 Mal pro Tag unter physiologischen Bedingungen ^auf1,2. Wenn diese Veränderungen nicht repariert werden, kann es zu einer Veränderung der DNA-Sequenzzusammensetzung kommen, die zu einer Mutation führt. Da Uracil in der DNA es vorzieht, sich während der Replikation mit dATP zu paaren, wenn Cytosin zu Uracil deaminiert, wird es in zwei Replikationsereignissen eine neue G: C zu A: T-Übergangsmutation in der Hälfte der Nachkommen ^DNA3 geben.

Unter den zellulären Strategien zur Aufrechterhaltung der genetischen Stabilität ist die Base Excision Repair (BER) ein wesentlicher Mechanismus, der beschädigte Basen wie Uracil in ^DNA4 repariert. Der BER ist ein hochgradig evolutionär konservierter Prozess. Es gibt zwei allgemeine BER-Signalwege: den Kurzfeldweg, der zu einem Reparaturtrakt eines einzelnen Nukleotids führt, und den Langfeldweg, der einen Reparaturtrakt von mindestens zwei Nukleotiden ^erzeugt5. Der BER ist ein koordinierter Mechanismus, der in mehreren Schritten erfolgt. Der erste Schritt im BER ist die enzymatische Hydrolyse der geschädigten Nukleotidbase durch eine schadensspezifische DNA-Glykosylase zur Erzeugung einer apurinisch/apyrimidinischen (AP) ^{Zwischenstelle6.} Es folgt die Spaltung des Zucker-Phosphat-Rückgrats an der AP-Stelle durch eine Endonuklease, die Reinigung der DNA-Endung durch eine Lyase, die Lückenfüllung durch eine DNA-Polymerase und die Versiegelung des letzten Nicks durch eine ^Ligase5.

Uracil-DNA-Glykosylase (UDG) hydrolysiert das Uracil aus Uracil-haltiger DNA für BER in Escherichia coli. Herkömmliche UDG-Assays mit radioaktiv markierter DNA mit unterschiedlichen Trenntechniken6,7,8,9,10,11,12,13 sind in der Regel zeitaufwendig, arbeitsintensiv, mit kostspieligen Markierungsreagenzien, komplizierten Verfahren und erfordern intensive Schulungen und ^Übungen, um das Risiko einer Exposition gegenüber radioaktiven Stoffen zu reduzieren. Fluorometrische Oligonukleotid-Assays wurden als Ersatz für die Radioisotopenmarkierung14 entwickelt, zusätzlich zu molekularen Beacons und Förster-Resonanzenergieübertragungstechnologie15,16,17,18,19,20. Für alle oben genannten Methoden ist jedoch eine spezifische Kennzeichnung erforderlich. Kürzlich wurden markierungsfreie Biosensor-Assays21,22,23 und kolorimetrische Methoden entwickelt, die auf der Bildung eines G-Quadruplex24,25,26 basieren. Mehrere A:U-Paare oder speziell entwickelte Sequenzen in den Sonden erschweren jedoch die Definition der Enzymeinheit.

MALDI-TOF MS ist eine Technologie, die bei der DNA-Analyse von großem Nutzen sein könnte. Zu den entwickelten Anwendungen gehören die Einzelnukleotid-Polymorphismus-Genotypisierung27,28, die modifizierte Nukleotidanalyse29 und die DNA-Reparatur-Zwischenidentifikation30,31,32,33,34. MALDI-TOF MS sollte leicht für die DNA-Glykosylase-Analyse eingesetzt werden, um AP-Site-haltige DNA-Produkte nachzuweisen. AP-Stellen in der DNA sind jedoch unter vielen experimentellen Bedingungen anfällig für ^{Strangbrüche33.} Hier wird ein UDG-Assay vorgestellt, der MALDI-TOF MS verwendet, um die AP-Standortproduktion ohne signifikantes Strangbruchrauschen direkt zu messen. Diese markierungsfreie Methode ist einfach zu bedienen und hat ein hohes Potenzial für die pharmazeutische Anwendung des DNA-Glykosylase-Inhibitor-Screenings.

1. Substrat-/Vorlagenvorbereitung

1. Entwerfen Sie Uracil-Substrat / Template-Duplex mit einem ausgewogenen G + C-Gehalt von ~ 50 ± 10% und einer minimalen Schmelztemperatur von 50 ° C für den Duplexbereich.
   HINWEIS: Ein Nukleotidunterschied zwischen 18 nt-Substraten und 19 nt-Schablonen (Tabelle 1 und Abbildung 1) trägt zu einer besseren MS-Signalinterpretation und einem geeigneten Glühen bei. Der Template-Strang dient als komplementäre DNA zur Erzeugung von A-U- oder G-U-Mismatches (Tabelle 1), kann aber auch als Referenzsignal in MS-Messungen verwendet werden. Die Verwendung von HPLC-gereinigten synthetischen Oligonukleotiden ist für diese Studie zufriedenstellend.
2. DNA in 1 mM EDTA und 10 mM Tris-HCl (pH 8,0 bei 25 °C) (TE) bei einer Konzentration von 100 μmol/L als Vorrat lösen und bei -20 °C lagern. Verdünnen Sie diesen 20-μL-Schaft mit TE auf ein Endvolumen von 800 μL (25-fache Verdünnung auf 4 μmol/L). Messen Sie die Absorption der DNA-Lösung in einem UV-sichtbaren Spektralphotometer bei λ = 260 nm, um die vom Hersteller zugewiesene Konzentration sicherzustellen. Zum Beispiel: A260 = 0,204 für 4 μmol/L von U+9 und A260 = 0,192 für 4 μmol/L von T1 (Tabelle 1).
3. Durchführung einer MALDI-TOF-MS-Analyse (Abschnitte 4-6) zur Qualitätskontrolle von Oligonukleotid, indem eindeutige Spitzensignale bei bestimmten m/z-Werten untersucht und überprüft wird, ob das Signal-Rausch-Verhältnis >100 beträgt (Abbildung 1B und Abbildung 1D).

2. DNA-Glykosylase-Assay

1. Unter Verwendung eines G:U-Substrats von T1/U+9-duplex (Tabelle 1 und Abbildung 1A) für die Glykosylase-Reaktion, beispielsweise in einem sterilen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, werden 70 μL _H2O, 10 μL 10x UDG-Reaktionspuffer, 5 μL T1-Material und 5 μL U+9-Material (Schritt 1.2) zugegeben.
   HINWEIS: Wählen Sie die richtige Art von Mikropipette und befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers, um das erforderliche Volumen zu handhaben. Verwenden Sie beispielsweise eine 2-μL-Pipette, um 0,1-2 μL Flüssigkeit zu dosieren, verwenden Sie eine 10-μL-Pipette, um 2-10 μL Flüssigkeit zu dosieren, und verwenden Sie eine 100-μL-Pipette, um 20-100 μL Flüssigkeit zu dosieren, um Genauigkeit und Präzision der Ergebnisse zu gewährleisten. Das beschriebene Volumen der Reagenzmischung gilt für 10 Assays; Passen Sie die Lautstärke an die gewünschte Anzahl von Reaktionen an. Der 1x UDG-Reaktionspuffer enthält 1 mM EDTA, 1 mM Dithiothreitol und 20 mM Tris-HCl (pH 8,0 bei 25 °C). Siehe die Materialtabelle für die Quelle des 10-fachen UDG-Reaktionspuffers.
2. Schließen Sie die Röhre sicher; Inkubieren Sie in einem Wasserbad für 30 min bei 65 ° C, dann für 30 min bei 37 ° C und schließlich auf Eis für 3 Minuten, um ein ordnungsgemäßes Glühen des Substrats / der Vorlagen-Duplex sicherzustellen.
3. In einem sterilen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen fügen Sie 49 μL eiskalten 1x UDG-Reaktionspuffer und 1 μL UDG (5.000 Einheiten/ml; siehe Materialtabelle) hinzu und verdünnen auf 0,1 Einheiten/μL. Führen Sie serielle Verdünnungen mit 1x UDG-Puffer auf die gewünschten Enzymkonzentrationen von 0,05, 0,02 oder 0,01 Einheiten/μL durch. Halten Sie das verdünnte UDG immer auf Eis.
   HINWEIS: In einer 10-μL-Reaktion können 0,1 Einheiten UDG in 3 min mehr als 30 pmol Uracil aus einem T1/U+9-Duplex spalten.
4. In einem sterilen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen 9,0 μL Substratmischung aus Schritt 2.2 zugeben und das Röhrchen auf 37 °C vorwärmen. Zugabe von 1,0 μL des verdünnten UDG aus Schritt 2.3. Verwenden Sie einen Timer, um die Reaktion zu timen, und bewegen Sie die Röhre, um den Inhalt zu mischen.
   HINWEIS: Für einen Unit-Definitionsassay beträgt die Inkubationszeit 30 min. Für einen kinetischen Assay verwenden Sie eine Zeitverlaufsanalyse von 0,5, 1, 2, 3, 5 Minuten, um die Anfangsrate zu erhalten. Für einen UGI-Inhibitionsassay wird die Reaktion für 15 min zeitlich begrenzt.
5. Zentrifugieren Sie die Röhrchen mit dem Reaktionsgemisch für 3-5 s bei 3.200 × g bei Umgebungstemperatur. Übertragen Sie dann die Reaktion sofort auf 37 °C.
6. Reaktionsabbruch
   1. Bereiten Sie Lösungen von 0,25 M HCl und 0,23 M Tris Base vor. In einem 15 ml Reagenzglas 10 ml einer Lösung von 1 mM EDTA und 20 mM Tris-HCl (pH 8,0 bei 25 °C) zugeben, um 1x UDG-Reaktionspuffer nachzuahmen. Ansäuern Sie mit 1 ml 0,25 m HCl und überprüfen Sie mit einem pH-Meter, um sicherzustellen, dass der pH-Wert ~ 2 ± 0,5 beträgt. Neutralisieren Sie mit 1 ml 0,23 M Tris-Basis und überprüfen Sie mit einem pH-Messgerät auf einen endgültigen pH-Wert von 6,5 ± 0,5.
      HINWEIS: Die Verwendung von pH-Teststreifen ist eine schnelle und einfache Möglichkeit, den pH-Wert der Reagenzmischung erneut zu bestätigen.
   2. Fügen Sie 1 μL 0,25 M HCl hinzu, um die 10 μL Reaktionsmischung anzusäuern, um das Enzym zu inaktivieren, und legen Sie es für 6 min auf Eis. Fügen Sie 1 μL 0,23 M Tris-Base hinzu, um die DNA-Produkte zu neutralisieren, um einen Bruch der AP-Stelle durch längere Säureexposition zu vermeiden. Fügen Sie 13 μL TE hinzu, um das Volumen der Produktmischung für den Matrixchiptransfer zu erhöhen, und legen Sie es dann auf Eis.
      HINWEIS: Das AP-Produkt ist chemisch instabil und sollte innerhalb von 2 Tagen von MALDI-TOF MS analysiert werden. Nach längerer Lagerung über mehr als eine Woche kommt es aufgrund von β/δ Eliminationsreaktionen der AP-Produkte zu einer Anhäufung eines erheblichen Teils der Strangbrüche (Abbildung 1D-G).
7. Übertragen Sie alle 25-μL-UDG-Reaktionsprodukte aus Mikrozentrifugenröhrchen auf eine 384-Well-Mikrotiterplatte.
   HINWEIS: Hohe Konzentrationen von Kationen, wie Natrium oder Kalium in Puffern, erzeugen Interferenzen in der MALDI-TOF MS-Analyse und erfordern daher eine Entsalzung. Da E. coli UDG-Reaktionspuffer sehr geringe Konzentrationen an Kationen enthält, ist eine Entsalzung nicht notwendig. Modifizieren Sie dieses Protokoll jedoch, um andere DNA-Glykosylase-Reaktionen zu messen, die Metallkationen enthalten, die wie zuvor beschrieben entsalzt werden ^müssen35.

3. UDG-Reaktionsprodukte auf einen Matrixchip übertragen

1. Öffnen Sie die Tür des Nanoliter-Dispensers (siehe Materialtabelle) und laden Sie die 384-Well-Mikrotiterplatte aus Schritt 2.7 auf den Plattenhalter des Decks.
2. Setzen Sie das Matrix-Chip-Array in die entsprechende Scout-Plate-Position ein. Legen Sie die geladene Scout-Platte auf das Verarbeitungsdeck des Nanoliter-Spenders und schließen Sie die Tür.
3. Berühren Sie die Lauftaste auf dem Transferbildschirm und warten Sie, bis das Gerät mit der Abgabe von Proben von der 384-Well-Mikrotiterplatte an den Matrixchip beginnt.
4. Verwenden Sie die Registerkarte Vision, um das Bild des Chips und die Dosiermengen für jede Stelle während der Dosierung anzuzeigen. Stellen Sie sicher, dass das gefleckte Volumen auf dem Chip im Bereich von 5-10 nL liegt.

4. Richten Sie die Assay-Parameter auf dem Massenspektrometer ein

1. Verwenden Sie das Anwendungsprogramm (siehe Materialverzeichnis), um eine .xlsx Datei mit dem vorhergesagten Signal-m/z-Wert für den Import vorzubereiten.
   HINWEIS: Die Einstellungen in DATEI I.xlsx (Tabelle 2) sind Beispieleinstellungen für den UDG-Assay des G:U-Substrats in Abschnitt 2.
2. Verwenden Sie das Anwendungsprogramm, um einen neuen UDG-Assay zu erstellen und zu definieren, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die Option Assaygruppe im Designerformat importieren klicken und die .xlsx Datei aus der Dropdown-Liste auswählen (z. B. DATEI I.xlsx aus Schritt 4.1).
3. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Schaltfläche Customer:Project:Plate und klicken Sie oben im Dropdown-Optionsbaum, um eine neue Assay-Platte einzurichten. Geben Sie im Dialogfeld einen Dateinamen ein (z. B. CTT20210620 für den Laborcode und das Assay-Datum), und wählen Sie in der Dropdownliste Plattentyp 384 Vertiefungen den Plattentyp 384 aus , und drücken Sie OK. Suchen Sie nach einer leeren Platte, die auf der rechten Seite des Bildschirms angezeigt wird.
4. Klicken Sie auf die Option Assay . Wählen Sie den Assay (z. B. FILE I.xlsx) aus der Dropdown-Liste aus.
5. Um den ausgewählten Assay (z. B. FILE I.xlsx) jeder Probenpunktposition auf der Platte zuzuweisen, bewegen Sie den Cursor an jede Position der leeren Platte, klicken Sie, um den Brunnen zu markieren, und klicken Sie mit der rechten Maustaste, um Plex hinzufügen auszuwählen.
6. Verwenden Sie einen Desktop- oder Laptop-Computer, um eine Arbeitsliste im .xlsx Format ohne Kopfzeile (z. B. 0620.xlsx von Tabelle 3) für alle Beispiele auf dem Chip aus Schritt 2.7 vorzubereiten. Klicken Sie auf die Schaltfläche Neues Beispielprojekt hinzufügen . Wählen Sie die Datei (z. B. 0620.xlsx) aus der Dropdown-Liste aus, um die Arbeitsliste zu importieren.
7. Suchen Sie in der Arbeitsliste (z.B. von 0620.xlsx) auf der linken Seite des Bildschirms nach allen Prüfmustercodes. Klicken Sie auf den Beispielcode in der Arbeitsliste, und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die entsprechende Position der Platte, um die Tests mit jeder Position zu verknüpfen.

5. Massenspektrometerbetrieb

1. Verwenden Sie das Anwendungsprogramm, um das Massenspektrometer (siehe Materialtabelle) mit dem zu analysierenden Probenchip (aus Abschnitt 3) zu verbinden.
2. Klicken Sie auf die Standardeinstellung. Geben Sie im Dialogfeld einen Dateinamen aus Schritt 4.3 ein (z. B. CTT20210620); Geben Sie im Feld Testname die Chip-ID in den Chip-Barcode ein und speichern Sie die Einstellungen.
3. Starten Sie das Massenspektrometer-Steuerprogramm (siehe Materialtabelle).
4. Drücken Sie die In/Out-Taste des Massenspektrometers und lassen Sie das Deck ausfahren. Nehmen Sie den Chiphalter heraus und stecken Sie den Probenchip aus Schritt 3.4 in den Chiphalter. Legen Sie den geladenen Chiphalter auf das verlängerte Deck und drücken Sie die In/Out-Taste, damit der Sample-Chip in das Instrument gelangt.
5. Doppelklicken Sie auf das Symbol Erwerben des Anwendungsprogramms. Klicken Sie im Fenster Erfassen auf die Registerkarte Automatisch ausführen , um das Instrument zu starten und Massenspektren von den Proben auf dem Chip zu erfassen.

6. Massenspektren betrachten und die Daten analysieren

1. Führen Sie das Datenanalyseprogramm aus (siehe Materialverzeichnis).
2. Durchsuchen Sie den Datenbankbaum und wählen Sie die Chip-ID aus Schritt 5.2 aus. Klicken Sie, um eine Zielvertiefung auf dem Chip zu markieren, und klicken Sie auf das Spektrumsymbol , um das Massenspektrum anzuzeigen.
3. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, um Anpassungsdialog auszuwählen, um einen bestimmten Spektrumbereich in einem neuen Fenster zuzuschneiden. Klicken Sie auf die X-Achse , um die obere und untere Grenze von m / z einzugeben, und drücken Sie OK, um das angegebene Bereichsspektrum einschließlich der interessierenden Signale anzuzeigen.
   HINWEIS: Die DNA-Menge ist proportional zur Spitzenintensität bei jeder m/z-Werteinheit.
4. Messen Sie die Spitzenhöhe der m/z-Werte der Signale, die dem U-Substrat, dem AP-Produkt und der Vorlage entsprechen. Klicken Sie auf den Gipfel und sehen Sie sich die Spitzenhöhe in der oberen linken Ecke des Bildschirms an.
   HINWEIS: Ein Spektrum von 1.600 Breite / 1.200 Einheit ist eine angemessene Dimension für die Inspektion auf einem Computerbildschirm sowie für die Aufbewahrung von Aufzeichnungen.
5. Um das Spektrum für die Aufzeichnung zu speichern, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Exportieren und wählen Sie in der Dropdown-Liste JPEG-Dateityp aus. Klicken Sie auf Ziel und Disc durchsuchen, um das Speichergerät in der Dropdown-Liste auszuwählen (z. B. Flash Disc E:). Geben Sie den Dateinamen ein (z. B. 0620_1-2.jpg) und klicken Sie auf Exportieren.
6. Drucken Sie bei Bedarf eine exportierte JPEG-Datei aus und messen Sie die Spitzenhöhe manuell mit einem Lineal.

Schablonen und Substrate
Am Beispiel synthetischer Oligonukleotide mit U in der Mitte (U+9) gepaart mit einer G-Schablone (Abbildung 1A) kann eine Leerkontrolle der äquimolaren Mengen an Schablone und Uracil-haltigem Substrat zur Qualitätskontrolle der Reinheit synthetischer Oligonukleotide verwendet werden (Abbildung 1B; die Signale stimmen mit dem angegebenen m/z und dem geringen Hintergrundrauschen überein). Für die MS-Datenanalyse wurden die Peakhöhen gemessen (Abbildung 2). Es wurde erwartet, dass die 19-nt-Template-DNA nach der Glykosylase-Hydrolyse unverändert bleibt; Daher könnte das Signal als Referenz für die Quantifizierung des AP-Produkts dienen (Abbildung 1C).

Reaktionszustand und Massenspektren
Dieser DNA-Glykosylase-Assay ist einfach und leicht mit einem nicht markierten Oligonukleotid für eine Standardreaktion durchzuführen, um saubere und zuverlässige Ergebnisse zu erzielen (Abbildung 1). Der Bereich der MS-Spektren sollte alle Signale abdecken, die von Substraten, Schablonen und Reaktionsprodukten erzeugt werden (Abbildung 1B). Die Differenz von 1 nt zwischen dem Substrat und der entsprechenden Schablone ergab ein gut getrenntes Signalprofil sowohl für die Schablone als auch für das Substrat (Abbildung 1B). Die äquimolaren Primer U+9 und T1 zeigten ähnliche Spitzenintensitäten ohne signifikante Unterschiede. Ein ausgedehnter Aufschluss von UDG (0,5 Einheiten für eine 30-minütige Reaktion) zeigte eine vollständige Uracilspaltung. Das Signal des AP-Produkts war auch gut von dem des Uracil-haltigen Substrats getrennt (Abbildung 1C d+9 AP-Produkt m/z = 5447,6 versus Abbildung 1B U+9 Substrat m/z = 5541,6). Die in dieser Studie verwendete relativ milde ^{MALDI-Ionisationstechnik36} minimierte die Signale, die mit Strangbrüchen assoziiert waren, die durch β-Eliminationsreaktion an AP-Stellen induziert ^wurden37, die in den Massenspektren nicht signifikant waren. Insgesamt ist der Reaktionshintergrund sehr sauber ohne merkliches Rauschen (Abbildung 1C).

Unter äquimolaren Bedingungen war die relative Signalintensität des AP-Produkts vergleichbar mit der des U-Substrats unter Verwendung der T1-Schablone als Referenz (Abbildung 1B, U+9/T1 versus d+9/T1). Somit basiert die Berechnung der UDG-Aktivität auf der exakten Eingabe des U-haltigen Substrats (50 pmol oder 20 pmol) nach Eq (1).

UDG-Aktivität = (Signal des AP-Produkts) / (Signal des U-Substrats + Signal des AP-Produkts) × [U] (1)

Kinetische UDG-Parameter, bestimmt durch MALDI-TOF MS-Assay
Wie in Abbildung 2 gezeigt, zeigten UDG-Reaktionen von 0,01 Einheiten bis 0,1 Einheiten während der gesamten 3-minütigen Reaktion sowohl Dosis- als auch Zeitabhängigkeit. Für die Bestimmung der _kinetischen Parameter Km und KCAT für ein G:U-Substrat wurde eine Konzentration von 3,2 pM (0,1 Einheiten pro 100 μL-Reaktion) verwendet (Tabelle 1). Die Aliquots der UDG-Reaktion wurden für 30 s und 60 s entfernt und abgeschreckt. Kinetische Daten wurden unter Bedingungen erhalten, unter denen das Uracil-haltige Substrat zu weniger als 50% verdaut war und fünf Substratkonzentrationen im Bereich von 10 bis 200 nM einer Analyse unterzogen wurden. Der Prästeady-State-Zeitverlauf zeigte eine ausgezeichnete Linearität für die Ratenanalyse. Ein Beispiel für ein Reaktionsgeschwindigkeitsdiagramm ist in Abbildung 3A dargestellt, in dem die relativen MS-Signalintensitäten des Produkts und des Substrats in Konzentration (nM) umgewandelt werden. Die UDG-Reaktionsgeschwindigkeit (v) wird als nM des pro Sekunde produzierten AP-Standorts dargestellt. Km und Vmax wurden aus einem Lineweaver-Burk-Diagramm berechnet (Abbildung 3B). Die aus dem MALDI-TOF MS-Assay abgeleiteten kinetischen UDG-Parameter wurden somit als Km = 50 nM, _Vmax = 0,98 nM s-1 und _Kcat = ^{9,31 s-1} bestimmt. Die Werte sind vergleichbar mit den Ergebnissen früherer 3H-Uracil-Freisetzungstests, bei denen Km = 40 nM und Kcat = 13,3 ^s-138 waren. 

Der G:U+9 Duplex wurde UDG-Sensitivitätstests unterzogen. Die mit dem MALDI-TOF MS-Assay gemessene Einheit wurde mit einer herkömmlichen 3H-Uracil-Freisetzungsmethode38 gegen die vom Hersteller definierte Einheit aufgetragen^. Wie in Abbildung 3C gezeigt, war die gemessene Einheit MALDI-TOF MS proportional zur definierten Einheit von 0,001 Einheiten bis 0,02 Einheiten mit der Korrelationsgleichung von y = 0,933x + 0,0003 und dem Bestimmungskoeffizienten ^{R2 = 0,9974}. Die Nachweisgrenze beträgt 0,001 Einheiten als Variationskoeffizient = 9,2%, ~5 mal das Signal-Rausch-Verhältnis. Somit bietet dieser MALDI-TOF MS-Assay eine ausreichende Empfindlichkeit, da UDG hauptsächlich auf Geräteebene verwendet ^wird39.

Substratspezifität von UDG
Eines der charakteristischen Merkmale dieses UDG MALDI-TOF MS-Assays ist, dass er markierungsfrei ist, was eine hohe Vielseitigkeit für das Substratdesign darstellt. Diese Funktion ist sehr nützlich für die Analyse der Substratspezifität von UDG. Wie in Tabelle 1 gezeigt, könnte Uracil an jeder Stelle in der Nähe des 5'- oder 3'-Endes von einzelsträngiger oder doppelsträngiger DNA für einen Spezifitätsassay eingefügt werden. Für die Substratspezifität ist bekannt, dass UDG sehr aktiv bei der Entfernung von Uracil aus einzelsträngiger ^DNA38 ist. In der Tat, wie in Tabelle 1 gezeigt, wurde die Uracilexzision aus dem einzelsträngigen Substrat (ssU) um das 3,7-fache verringert, wenn sie auf den komplementären DNA-Strang geglüht wurde, wodurch G:U-Duplex gebildet wurde. Für das häufig verwendete A:U-Duplex ^6,7,8 wurde die Reaktionsgeschwindigkeit im Vergleich zu ssU um das fast 10-fache gesenkt. Die UDG wirkte nicht auf U am DNA-Terminus (Tabelle 1 Substrate von G:U+1, G:U-1 und G:U-2), was mit früheren Studien ^{übereinstimmt40,41}. Interessanterweise zeigte U an der 2. und 3^. Position vom 5'-Endpunkt eine höhere UDG-Katalysatorrate als das U in der Mitte um das 2-fache bzw. 1,5-fache (Tabelle 1, G:U+2 und G:U+3 gegenüber G:U). UDG entfernte U 3-nt aus dem 3'-Ende mit 8% weniger Aktivität als das U in der Mitte (Tabelle 1, G:U-3 versus G:U).

Uracil-Glykosylase-Inhibitor hemmt die UDG-Reaktion
Der Uracil-Glykosylase-Inhibitor (UGI) ist ein Bakteriophagenprotein, das E. coli UDG durch reversible Proteinbindung mit einer Stöchiometrie von 1:¹⁴² hemmt. Die Hemmung der UDG-Aktivität durch UGI ist in Abbildung 4 dargestellt. In Gegenwart von 0,05 Einheiten (100 pM) UGI wurde die Aktivität von 0,05 Einheiten UDG (8 pM) auf ein nicht nachweisbares Niveau gehemmt. Der _IC50 war 7,6 pM. So kann der UDG MALDI-TOF MS-Assay leicht zu einem Massenscreening-Assay für die Entdeckung von Inhibitoren anderer DNA-Glykosylasen modifiziert werden.

Abbildung 1: Modellsystem für einen DNA-Glykosylase-Assay. (A) Der Läsionsstrang, der ein einzelnes Uridin (U+9) enthielt, wurde zu einer Schablone (T1) geglüht und bildete eine G:U-Fehlanpassung (fett). Uracil-DNA-Glykosylase erkennt und entfernt das Uracil und bildet eine AP-Stelle (d). Bei einer MALDI-TOF-MS kann der Unterschied der m/z-Werte zwischen U-haltiger DNA und AP-Produkten wie in B gezeigt aufgelöst werden. (B) Eine 18-nt-DNA, die ein einzelnes Uridin (U+9) enthielt, das zu einer 19-n-Vorlage (T1) geglüht wurde (Tabelle 1), wurde als Enzymrohling von 50 pmol Substrat in 40 μL Reaktionspuffer getestet und einer MS-Analyse unterzogen. (C) Ein nahezu vollständiger Enzymaufschluss von 50 pmol Substrat in einer 10-μL-Reaktion unter Verwendung von 0,5 Einheiten UDG bei 37 °C für 30 min. (D) Eine 18-nt-DNA, die ein einzelnes Uridin (U+3) enthielt, das zu T1-Enzym blank von 50 pmol-Substrat in 40 μL Reaktionspuffer geglüht wurde, wurde einer MS-Analyse unterzogen. (E) Ein nahezu vollständiger Enzymaufschluss von 50 pmol U+3-Substrat in einer 10-μL-Reaktion unter Verwendung von 0,5 Einheiten UDG bei 37 °C für 30 min zur Erzeugung von d+3 und einer MS-Analyse innerhalb von 30 h. (F) Die Reaktionsbedingung war die gleiche wie in E, mit der Ausnahme, dass das d+3-Produkt 30 min lang in 0,1 M NaOH bei 95 °C lag, um eine Beta-Eliminierungsreaktion auszulösen, die B15-fragmentiertes Produkt erzeugte. und einer MS-Analyse unterzogen. g) die Reaktionsbedingung war die gleiche wie in E, mit der Ausnahme, dass das Produkt d+3 bei -20 °C länger als 7 Tage gelagert wurde; ein Bruchteil von d+3, der in fragmentierte B15-Produkte umgewandelt wurde. Diese Zahl wurde von ⁴³ geändert. Abkürzungen: nt = Nukleotid; MS = Massenspektrometrie; MALDI-TOF MS = Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization time-of-flight MS; AP = apurinisch/apyrimidin; UDG = Uracil-DNA-Glykosylase; T1 = 19 nt G-haltige Vorlage; U+9 = 18 nt U-haltiges Substrat; d+9 = 18 nt AP standorthaltiges Produkt; U+3 = 18 nt U-haltiges Substrat; d+3 = 18 nt AP standorthaltiges Produkt; B15 = 15 nt beta-elimination fragmentiertes Produkt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Zeitverlaufsanalyse der UDG-Aktivität bei verschiedenen Enzymkonzentrationen. Substrat-DNA, 50 pmol, die eine G:U-Läsion enthielt, wurde mit 0,01, 0,02, 0,05 und 0,1 Einheiten UDG bei 37 °C inkubiert. Aliquote (10 μL) wurden aus dem Reaktionsgemisch bei 0, 0,5, 1, 2 und 3 min entnommen und mit einem gleichen Volumen an Phenol/Chloroform abgeschreckt. (A) MALDI-TOF-Massenspektren, die die Konzentrationsabhängigkeit der Verarbeitung von G:U-Substraten durch UDG veranschaulichen. (B) Die Produktmenge wurde als Funktion der Zeit dargestellt. UDG: 0,01 (geschlossene Dreiecke mit durchgezogener Linie), 0,02 (offenes Dreieck mit gestrichelter Linie), 0,05 (geschlossener Kreis mit durchgezogener Linie) und 0,1 Einheiten (offene Kreise mit durchgezogener Linie). Die Daten sind die Mittelwerte von drei unabhängigen Bestimmungen, und die Fehlerbalken stellen 1 S.D. dar. Diese Zahl wurde von ⁴³ geändert. Abkürzungen: nt = Nukleotid; MALDI-TOF = Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization time-of-flight; AP = apurinisch/apyrimidin; UDG = Uracil-DNA-Glykosylase; T = 19 nt G-haltige Vorlage; U = 18 nt U-haltiges Substrat; AP = 18 nt AP Site-enthaltendes Produkt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Bestimmung kinetischer Parameter von UDG mittels MALDI-TOF-Analyse. Michaelis-Menten-Kurve und Lineweaver-Burk-Diagramme zur Bestimmung von Km und kcat für die enzymkatalysierte UDG-Exzision von Uracil aus der DNA. Der DNA-Glykosylase-MALDI-TOF-MS-Assay wurde unter Verwendung von 0,1 Einheiten UDG und unterschiedlichen Konzentrationen (10, 30, 60, 100, 200 nM) von Substraten in 100 μL-Reaktion für 30 s und 60 s durchgeführt. (A) Michaelis-Menten-Kurve, die aus drei unabhängigen Experimenten generiert wurde. Die Fehlerbalken stellen 1 SD dar. (B) Lineweaver-Burk-Plot für den Assay; die angegebenen Abschnitte ermöglichen die Berechnung von Km und Vmax. (C) UDG-Assay durch MALDI-TOF-MS-Analyse im Vergleich zur vom Hersteller zugewiesenen Einheit. Die Enzymaktivität wurde durch Uracilentfernung unter Bildung der AP-Stelle in einer 10-μL-Reaktion gemessen, die 50 pmol (0,56 μg) G:U innerhalb eines 18/19 nt DNA-Duplex für 30 min bei 37 °C enthielt. Das UDG wurde mit Puffer [50% Glycerin, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 30 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 1 mM Dithiothreitol] auf Eis verdünnt. Eine Einheit wurde als die Menge an Enzym definiert, die die Freisetzung von 60 pmol Uracil pro Minute katalysierte. Fehlerindikatoren zeigen die Standardabweichung von sechs Experimenten. Diese Zahl wurde von ⁴³ geändert. Abkürzungen: nt = Nukleotid; MALDI-TOF = Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization time-of-flight; UDG = Uracil-DNA-Glykosylase; AP = apurinisch/apyrimidin; V, Reaktionsgeschwindigkeit nM/s. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Hemmkurve des UDG-Enzyms durch Zugabe von UGI. Die Hemmkurve wurde unter Verwendung von Reaktionen von 20 μL mit 0,05 Einheiten UDG (8 pM) und 50 pmol Substrat für 15 min in Gegenwart von UGI von 0,001 Einheiten (5 pM) bis 0,1 Einheiten (200 pM) bestimmt. Daten sind die Mittelwerte von drei unabhängigen Bestimmungen, und die Fehlerbalken stellen 1 SD dar. Die Daten passen zu einem _{Online-IC50-Rechner} (siehe Materialtabelle). Diese Zahl wurde von ⁴³ geändert. Abkürzungen: UDG = Uracil-DNA-Glykosylase; UGI = Uracil-Glykosylase-Hemmer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Tabelle 1: Substratzusammensetzungen und UDG-Spezifitäten. Diese Tabelle zeigt die 18 nt U-haltige DNA, die von U±N bezeichnet wird. Das '+' gibt an, die Uracil-Position vom 5'-Terminus aus zu zählen, und das '-' zeigt das Zählen der Uracil-Position vom 3'-Terminus an. Zum Beispiel ist U + 9 die 9. Position von der 5' Endstation, U-3 ist die 3^. Position von der 3' Endstation. Die komplementäre 19-nt-Vorlage von T1 bis T7 würde mit der U-haltigen DNA gepaart werden, die G: U- oder A: U-Mismatches bildet, wie angegeben. Uracil-Basen sind fett gedruckt. Die Reaktionen erfolgten unter Verwendung von 50 pmol U-Substraten, 0,05 Einheiten UDG, in 10 μL, wie in Protokollabschnitt 2 beschrieben. Diese Tabelle wurde von ⁴³ geändert. Abkürzungen: UDG = Uracil DNA Glykosylase; nt = Nukleotid; ND, nicht nachweisbar.

Tabelle 2: DATEI I.xlsx Die Einstellungen wurden für Abbildung 1B, C und Abbildung 2A verwendet. 0 min Einträge. Das in dieser Studie verwendete MALDI-TOF-MS-System wurde speziell für die Analyse des Einzelnukleotid-Polymorphismus durch eine Einzelnukleotid-Erweiterung des erweiterten Primers in den Bereich der amplifizierten Gensequenzvariation entwickelt. Für den UDG-Assay wurden bei der Vorbereitung der Assay-Gruppe FILE I nur sechs Felder verwendet. Abkürzungen: WELL = die dem Assay zugewiesene Bohrlochnummer; TERM = Terminierungsmix; SNP_ID = Name der Eingangssequenz des Einzelnukleotidpolymorphismus; 2nd-PCRP = Forward Amplicon Primer; 1st-PCRP = Reverse Amplicon Primer; AMP_LEN = Amplikonlänge; UP_CONF = Uniplex-Verstärkungspunktzahl; MP_CONF = Multiplex-Verstärkungs-Score; Tm = Schmelztemperatur; PcGC = Prozent GC-Gehalt; PWARN = Assay Design Warncodes; UEP_DIR = Richtung der Primerausdehnung; UEP_MASS = unverlängerte Primermasse; UEP_SEQ = unextended-primer sequence; EXT1_CALL = Bezeichnung für den Massenpeak des Analyten 1; EXT1_MASS = Masse des Analyten 1.

Tabelle 3: 0620.xlsx Datei. Diese Einstellungen wurden für die UGI-Hemmreaktionen in Abbildung 4A verwendet. Abkürzung: UGI = Uracil Glycosylase Inhibitor.

Dieses Papier bietet ein detailliertes Verfahren für die Verwendung einer UDG MALDI-TOF MS-Assay-Methode zum direkten Nachweis von AP-haltigen DNA-Produkten. Die Hauptvorteile dieser Methode bestehen darin, dass Uracil-haltige Substrate markierungsfrei, skalierbar, einfach zu verarbeiten sind und eine größere Flexibilität im Substratdesign bieten.

Die vom UDG-Lieferanten empfohlene Phenol/Chloroform-Extraktion ermöglicht die Inaktivierung des Enzyms, um den Abbau der Produkt-DNA zu verhindern. Das Phenolextraktionsprotokoll beinhaltet jedoch eine langwierige Phasentrennung gefährlicher Chemikalien. Eine alternative Säureabschlussmethode unter Verwendung von HCl zur Senkung des Reaktions-pH-Wertes auf 2 ± 0,5 inaktivierte ebenfalls effektiv UDG. Eine anschließende Neutralisation mit Tris-Base könnte DNA-Schäden verhindern. Wenn das AP-Produkt innerhalb von 30 Stunden einer MS-Analyse unterzogen wurde, gab es keine Anzeichen für einen Basenverlust oder eine Modifikation in den Massenspektren (Abbildung 1E). Der Tris-Puffer in den Reaktionen wurde mit dem kommerziellen UDG bereitgestellt. Verschiedene Amine, einschließlich Tris, können jedoch AP-Stellen durch Beta-Eliminierung inzisieren, wenn auch bei hohen Reagenzkonzentrationen44. Einige Alternativen, wie HEPES und Phosphatpuffer, können in Betracht gezogen werden, um das Risiko einer Spaltung der AP-Stelle durch Beta-Eliminierung zu vermeiden.

Als potentielle UDG-Referenzmethode wird aus folgenden Gründen ein Duplex aus zentriertem G:U-Substrat (Tabelle 1, T1/U+9) als Standardsubstrat empfohlen: 1. Für die physiologische Relevanz ist G:U A:U überlegen, da die Desaminierung von Cytosin in G:C-Paaren zu G:U-Läsionen führt. 2. Während E. coli UDG eine höhere Spezifität zeigt, um U aus einzelsträngiger DNA zu hydrolysieren, ist die Reparatur einer U-Läsion in einzelsträngiger DNA ungewöhnlich. 3. Für alle getesteten G:U-Substrate zeigten G:U+2 und G:U+3 höhere Reaktionsgeschwindigkeiten als G:U+9. Eine DNA-Deaminierungsläsion neben einem Strangbruch ist jedoch ungewöhnlich. Für die Nachahmung nativer Läsionen wäre es angemessener, ein G: U in der Mitte des DNA-Duplex zu platzieren.

Interessanterweise erzeugte die MALDI-TOF-MS-Methode kinetische UDG-Parameter, und die Enzymeinheiten der G:U-Reaktion (Abbildung 3A-C) waren den konventionell abgeleiteten Ergebnissen mit 3H-Uracil38 sehr ähnlich. Das einzelne G:U-Substrat in dieser Studie unterscheidet sich jedoch stark von PBS1-Bakteriophagen-DNA, die zuvor mit mehreren A:U aus DNA-Synthesefehlern beschrieben ^wurde38. Darüber hinaus zeigte UDG mit G:U eine 3-mal höhere Aktivität als mit dem A:U-Substrat (Tabelle 1, _Km und _Kcat von G:U gegenüber A:U). Dieses scheinbar widersprüchliche Ergebnis kann auf die DNA-Sequenz des PBS1-Substrats zurückgeführt werden, das 36% U in Form von multiplen A:U-Läsionen45 enthält^, verglichen mit nur 3% von U im G: U-Substrat (Tabelle 1). Inzwischen ist UDG ein sehr "prozessives" Enzym, d.h. ein einzelnes Protein-DNA-Bindungsereignis löst multiple Uracil-Spaltungen ^aus12. Der Befund einer nahezu perfekten Eins-zu-eins-Korrelation zwischen diesen beiden UDG-Methoden macht diese MS-Methode zu einer attraktiven Option anstelle des traditionellen Radioisotopen-Assays.

Dieser Ansatz ist leicht skalierbar. Alle UDG-Reaktionen in dieser Studie wurden manuell mit Mikropipetten und Mikrozentrifugenröhrchen durchgeführt, wobei an einem bestimmten Tag ~ 30 Tests durchgeführt wurden. Somit wurde weniger als ein Zehntel der Kapazität des in den Abschnitten 3-5 beschriebenen 384-Well-Plattenformat-Chiparrays für das MALDI-TOF-MS-System (siehe Materialtabelle) verwendet. Im Gegensatz dazu könnte die Anpassung eines automatisierten Pipettiersystems für eine 384-Well-Mikrotiterplatte die tägliche Leistung dieses Ansatzes durch die Verwendung der Säureterminierungsmethode leicht erhöhen. Somit würden 300 UDG-Reaktionen ~1 Stunde dauern. Das MALDI-TOF MS-System (siehe Materialtabelle) konnte Massenspektrendaten für bis zu 300 Reaktionen in 1 h ausgeben. Daher würde ein optimierter Prozess 2 Stunden dauern, um 300 UDG MALDI-TOF MS-Assays durchzuführen.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Wir danken der NCFPB Integrated Core Facility for Functional Genomics (Taipei, Taiwan) und dem NRPB Pharmacogenomics Lab (Taipei, Taiwan) für ihre technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde vom Ministerium für Wissenschaft und Technologie, Taiwan, R.O.C. unterstützt [Fördernummer MOST109-2314-B-002 -186 an K.-Y.S., MOST 107-2320-B-002-016-MY3 an S.-Y.C., MOST 110-2320-B-002-043 an W.-h.F.]. H.-L.C. ist Stipendiat der National Taiwan University. Finanzierung der Open-Access-Gebühr: Ministerium für Wissenschaft und Technologie, R.O.C.