Mit 22 3 Anti-PD-L1-Antikörper konzentrieren sich auf Biopsie und Zytologie Proben von Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkrebs

Um die Fähigkeit des Labors weltweit, die Förderfähigkeit von Patienten mit Lungenkrebs Behandlung mit Pembrolizumab, auf eine zuverlässige und reproduzierbare Weise beurteilen zu erweitern, haben wir eine Probe, die das 22 3 Antikörper-Konzentrat auf eine weithin verfügbar verwendet entwickelt. immunhistochemische Autostainer, Biopsie und Zytologie Proben.

Pembrolizumab-Monotherapie ist für die First- und Second-Line-Behandlung von Patienten mit PD-L1-mit dem Ausdruck ihrer fortgeschrittenen nicht-kleinzelligen-Lungenkrebs (NSCLC) zugelassen. Test für PD-L1-Ausdruck mit dem PD-L1 Immunhistochemie (IHC) 22 3 Begleiter diagnostischen Assay, wodurch einen Tumor-Anteil (TPS) Gäste, auf Tumorgewebe validiert wurde. Wir entwickelten einen optimierte Labor entwickelten Test (LDT), der 22 3 Antikörper (Ab) Konzentrat auf eine weithin verfügbar IHC Autostainer Biopsie und Zytologie Proben verwendet. Der PD-L1-TPS wurde mit 120 gekoppelten ganze Tumorgewebe Abschnitte und Biopsie Proben ausgewertet und gepaart mit 70 Biopsie und Zytologie Proben (bronchiale Waschungen, n = 40; pleural Ergüsse, n = 30). Die 22 3 Ab das Konzentrat-basierte LDT zeigte eine hohe Übereinstimmung zwischen Biopsie (~ 100 %) und Zytologie (~ 95 %) Exemplare im Vergleich zum PD-L1 IHC Ausdruck anhand der PD-L1 IHC 22 3 Begleiter Assay an beiden TPS Schnitt Punkte (≥1 %, ≥50 %). Die optimierte LDT das hier vorgestellte mit 22 3 Ab Konzentrat den PD-L1-Ausdruck in beiden Tumorgewebe und zytologische Proben bestimmen wird die Fähigkeit des Labors weltweit zur Bewertung der Förderfähigkeit von Patienten mit NSCLC für die Behandlung mit erweitern Pembrolizumab-Monotherapie in zuverlässig und reproduzierbar.

Neue klinische Studien belegen die Wirksamkeit von Pembrolizumab, ein humanisierter monoklonaler IgG4 Kappa Isotype Antikörper, die die Interaktion zwischen den programmierten Zelltod 1 (PD-1) blockiert und die Liganden, PD-L1 und PD-L2, bei der Behandlung von Patienten mit fortgeschrittenen NSCLC^1,2,3,4.

Derzeit Pembrolizumab zur Behandlung von NSCLC PD-L1 mit dem Ausdruck in beiden Behandlung-naiven Patienten mit PD-L1 Ausdruck TPS ≥50 % und keine epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) oder anaplastische Lymphom Kinase (ALK) Tumor genomische Aberrationen^{3 zugelassen} und für vorher behandelte Patienten mit einem PD-L1-TPS ≥1 %¹.

PD-L1-Protein-Expression von IHC erkannt wurde weithin als eine prädiktive Biomarker-Assay für Anti-PD-1/PD-L1 Therapien eingesetzt wurde. In klinischen Studien Pembrolizumab war der PD-L1-TPS mit Formalin fixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Gewebeproben erhalten anhand der PD-L1 IHC 22 3 Begleiter Assay⁵. Dieser Test wurde von der US Food and Drug Administration (FDA) genehmigt und wurde CE-Kennzeichnung in Europa für die Bestimmung des Tumors PD-L1 TPS⁵.

Weitere globale Optionen über Einrichtungen für zuverlässige und qualitativ hochwertige Auswertungen der PD-L1 TPS mit LDTs die 22 3 Antikörper Konzentrat verwenden sind unerlässlich, um klinische Entscheidungen bezüglich Patienten Anspruch auf Pembrolizumab unterstützen Behandlung. Eine große Anzahl von Pathologie-Laboratorien haben keinen Zugriff auf der Begleiter diagnostische PD-L1 IHC 22 3 Test. Daher ist die Entwicklung von zuverlässigen und Konstanten LDTs kompatibel mit zusätzlichen, weithin verfügbar IHC Autostainer Plattformen wichtig.

Darüber hinaus gibt es eine notwendige Schaffung LDTs mit zytologische Proben, die einzige Exemplar von NSCLC-Patienten häufig erhältlich sind. Der PD-L1 IHC 22 3 Begleiter Assay ist validiert für Resektionen, Kern Nadel Biopsien und Bronchoscopies nur dann, wenn die Bronchoskopie 100 Tumorzellen ergibt. Obwohl die oben genannten Probenarten häufig erhalten werden, zytologische Proben werden leichter gesammelt und sind die am weitesten verbreitete Probentyp in einigen Institutionen^6,7. Allerdings gibt es derzeit keine validierten diagnostischen Test für die Auswertung des Ausdrucks PD-L1 in zytologische Proben zur Verfügung; kompatibel mit zytologische Proben zuverlässig LDTs würde weiter qualitativ hochwertige PD-L1 Prüfung erleichtern.

Darüber hinaus sollte bei der Festlegung der klinischen Validierung eine LDT der IHC in ähnlicher Weise auf die entsprechenden klinisch validierte kommerziellen Test⁸durchgeführt werden. Zum Beispiel sollte mehrere kritische Schritte überprüft werden, um das gleiche Signal in Schnittserien wie Antikörper-Titration, Vorbehandlung Verzögerungen, Inkubationszeit und Verstärkung Systeme⁹zu erhalten.

Wir haben vor kurzem eine optimierte LDT, die das 22 3 Antikörper-Konzentrat verwendet den PD-L1-Ausdruck auf Tumor Biopsien und zytologische Proben^10,11auswerten entwickelt. Wir fanden eine hohe Übereinstimmung mit der LDT im Vergleich zu der "Goldstandard" PD-L1 IHC 22 3 Assay^10,11. Dieses klinisch validierte Protokoll wird zuverlässige, qualitativ hochwertige PD-L1 Tests in den Regionen weltweit unterstützen.

Alle Verfahren wurden von der lokalen Ethikkommission genehmigt (menschliche Forschungsethikkommission, Centre Hospitalier Universitaire de Nizza/Tumorothèque BB-0033-00025).

Hinweis: Dieses Protokoll ist speziell für den Einsatz von die 22 3 Antikörper konzentrieren sich auf eine kommerziell erhältliche automatisierte IHC Stainer (bezeichnet als Autostainer hier, die Tabelle der Materialiensehen) für Tumor Biopsien und zytologische Proben angepasst.

1. Vorbereitung des Tumorgewebes Proben

1. Beheben von Tumorgewebe in 10 % neutral gepuffertem Formalin (NBF) in einer Kassette.
   Hinweis: Tumorgewebe von proximalen Lungentumoren erhält man in der Regel durch Bronchoskopie, durch einen Pneumologen oder Lungenfacharzt unter mäßiger Sedierung durchgeführt. Für periphere Läsionen und diffuse Lungenerkrankungen wird eine Transbronchial oder Nadel-Biopsie angezeigt. Diese Verfahren sind in der Regel in einem Operationssaal oder Intensivstation durchgeführt.
2. Die Kassette in Paraffin einbetten.
   Hinweis: Fixierung durch Perfusion oder Eintauchen unmittelbar nach Dissektion erreicht werden und erfordert in der Regel 8 – 10 h. Das Fixativ Laufwerk sollte 15 – 20 X höher als das Volumen der Probe. Es wird nicht empfohlen, Biopsie Gewebe für mehr als 10 h zu beheben da Overfixation Maskierung des Antigens führen kann. Die Fixierung-Geschwindigkeit ist etwa 1 mm/h bei Raumtemperatur.
3. Infiltrieren die festen Gewebeprobe mit Wachs in der Gewebe-Prozessor (siehe Tabelle der Materialien).
   Hinweis: Austrocknung erfolgt in drei Alkohol Bäder mit steigenden Konzentrationen 70 %, 85 % und 90 %. Wasser wird schließlich durch die drei letzten absoluten Alkohol Bäder entfernt. Die Verrechnung erfolgt in drei Toluol Bäder und das Wachs Eindringen in heiße wachsbäder (44 – 60 ° C).
4. Das Gewebe in eine Form gefüllt mit geschmolzenem Paraffin einbetten (siehe Tabelle der Materialien) und warten Sie erstarren.
5. Abschnitt der Paraffin-eingebetteten Gewebe bei einer Dicke von 3 μm auf ein Mikrotom.
6. Übertragung der Paraffin-Band zu einem positiv geladenen Mikroskop Glas schieben (siehe Tabelle der Materialien).
7. Trocknen Sie die Folie für 1 h bei 37 ° C.
   Hinweis: Bewahren Sie die Gewebeschnitte bei 2 – 8 ° C (bevorzugt) oder bei Raumtemperatur bis zu 25 ° C Antigenität zu bewahren, und Flecken innerhalb 15 d-Schnitt.

2. Vorbereitung der zytologische Proben

1. Bronchiale Waschungen in einer konservierenden Lösung zu sammeln (siehe Tabelle der Materialien).
   Hinweis: Hierzu ist standard Bronchoskopie Technik verwendet.
   1. Die Verteilung der Bronchus zu untersuchenden Lavage. Sammeln Sie die Wäsche in einem sauberen Behälter. Label der Container mit dem Patienten vor- und Nachname, Geburtsdatum und Probenquelle.
2. Übertragen Sie die Bronchien Waschungen in ein 50 mL konische Röhrchen geben und 2 g DL-Dithiothreitol Pulver (siehe Tabelle der Materialien), Wirbel der Röhre für 30 min und Zentrifugieren Sie es bei 250 X g für 5 min bei Raumtemperatur.
3. Den überstand zu entfernen und 10 mL einer schleimlösende Lösung (siehe Tabelle Material).
4. Schütteln Sie die Probe für 20 min bei mittlerer Geschwindigkeit (Stufe 9) und bei 250 X g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugiert.
5. Den überstand zu entfernen und die Zelle Pellet in Röhrchen mit 10 % einzahlen NBF.
6. 4 Tropfen einer Zelle Block Vorbereitung Reagenz (siehe Tabelle der Materialien), die Zelle Pellet.
7. Übertragen der Zelle Pellet auf eine Kassette, in 10 % fix NBF, und Paraffin-Binde sie für Zelle Block Vorbereitung und schneiden (siehe Schritte 1,1 – 1,7).

3. PD-L1 Färbung Assay

1. Die Autostainer und den Computer einschalten.
2. Doppelklicken Sie auf das Autostainer-Symbol und wählen Sie den Benutzer.
3. Klicken Sie auf "Create Label" und dann auf "Protokoll".
4. Doppelklicken Sie auf das Protokoll 22 3.
   Hinweis: Das Protokoll wird zuerst auf die Autostainer Computer durch Klicken auf "Protokoll erstellen"installiert. Das vollständige Protokoll wird als ergänzende Datei 1bereitgestellt.
5. Schreiben Sie die Patienten-ID auf dem Etikett zu, und klicken Sie auf "Drucken".
6. Kleben Sie das Etikett auf der Folie.
7. Öffnen Sie die Folie Schublade durch Drücken auf die Taste der Schublade, die gewählt wurde.
8. Legen Sie die beschriftete Folie auf das Wärmeleitpad mit dem Etikett nach oben und nach innen.
9. Schließen Sie die Folie Schublade.
10. Entfernen Sie die Kappen von den Spendern und laden Sie Reagenzien auf die Reagenzien Racks zu.
11. Öffnen der Motorhaube die Stainer und die Regale auf die Reagenzien Karussell dafür sorgen, dass sie fit und halten Sie in Position.
12. Schließen Sie die Haube.
13. Die Software klicken Sie auf das Instrument, das verwendet wird, und klicken Sie auf "Ausführen".
14. Am Ende des Verfahrens IHC spülen Sie die Folie für einige Sekunden mit Wasser aus dem Wasserhahn und einen Tropfen einer Reinigungslösung.
15. Rehydrieren Sie die Folie mit einem Bad von Ethanol 100 % und einem zweiten Bad von Ethanol 95 % für einige Sekunden.
16. Legen Sie die Folie in die eindecken-Maschine für ein automatisiertes Laden von das Deckglas.

4. Interpretation der PD-L1 Färbung

Hinweis: Ein qualifizierter Pathologe sollte die Auslegung des PD-L1-IHC-Tests durchführen.

1. Die Qualität der PD-L1 Färbung durch die Analyse der positiven und negativen Kontrollen vor der Untersuchung des Patienten Probe zu bewerten.
   Hinweis: Die Ergebnisse, die auf den Patienten Probe gelten als ungültig, wenn die Färbung der Steuerelemente nicht akzeptabel ist.
2. Bestätigen Sie die Anwesenheit von mindestens 100 lebensfähigen Tumorzellen unter dem Mikroskop.
   Hinweis: Bericht, wenn der Patient Exemplar weniger als 100 Tumorzellen hat.
3. Werten Sie bei einer niedrigen Vergrößerung von 4 X aus allen erhaltenen positiven und negativen Tumor Bereichen.
   Hinweis: Bei einer niedrigen Vergrößerung kann teilweise Membran Färbung oder Membran Färbung des schwachen Intensität (1 +) schwer zu erkennen sein.
4. Teilweisen oder vollständigen Zellmembran Färbung der Gäste.
   Hinweis: Die zytoplasmatischen Färbung Auslegung ausgeschlossen werden muss.
5. Berechnen Sie die TPS durch die Bewertung des Anteils der PD-L1 positive Tumorzellen im Vergleich zu allen Tumorzellen in der gut erhaltenen Tumor-Bereichen.
   Hinweis: Nur lebensfähigen Tumorzellen sollte untersucht werden. Alle anderen zellulären Elemente wie Immunzellen, nekrotische Zellen, normale Zellen und Artefakte, müssen von der Prüfung ausgeschlossen werden.

Mit dem Verfahren präsentiert hier und wie beschrieben im Detail in dieser Gruppe den letzten Veröffentlichungen^10,11, wurde optimierte LDT klinisch mit 120 Archivierung FFPE NSCLC Biopsie Proben von Patienten validiert, die eine chirurgische Resektion oder eine Biopsie an der Universitätsklinik von Pasteur, Nizza, von März 2007 bis März 2016. Darüber hinaus wurde für die Bewertung der PD-L1 Ausdruck zytologische Proben, TPS in 70 gepaarten Biopsie Gewebeproben und Zelle Blöcke, die aus Bronchien Waschungen bereit waren bewertet (n = 40) oder pleural Ergüsse (n = 30) (gesammelt am Pasteur University Hospital, schön, Juli 2014 bis November 2016). Alle Folien wurden frisch geschnitten und gefärbt innerhalb von 24 Stunden.

Ein Vertreter Färbung Muster mit Biopsie, die Proben mit den 22 3 Antikörper-Konzentrat (LDT), im Vergleich mit dem PD-L1 IHC 22 3 Begleiter Assay (Gold Standard) in Abbildung 1A und 1 bdargestellt ist. Mit TPS ≥1 % 54/120 Fälle (45 %) waren PD-L1 positiv, während der Verwendung einer TPS ≥50 %, 29/120 Fällen (24 %) wurden als positiv für PD-L1.

Der Intraclass-Korrelationskoeffizient (ICC) verwendet, um die Korrelation der TPS Partitur als eine kontinuierliche Variable zu messen war 99 % zwischen der LDT und dem Gold-Standard. Mit beiden die TPS Schnitt Punkte von ≥1 % und ≥50 %, die κ-Noten für interpathologist Vereinbarung wurden gleich 1 innerhalb der LDT-Plattform.

Ein Vertreter Färbung Muster mit Zytologie, die Proben mit den 22 3 Antikörper auf die LDT im Vergleich mit dem PD-L1 IHC 22 3 Kit (Gold Standard) zu konzentrieren ist in Abbildung 1 und 1 Dgezeigt. Die Konkordanz von 70 Paaren der Biopsie und Zytologie Proben mit der LDT mit entweder einer von TPS Zinssenkung Punkte von ≥1 % und ≥50 % war größer als 95 % und dem ICC über die TPS-Punktzahl, da eine kontinuierliche Variable zwischen 0,88 und 0.90 war. Dieser Befund entsprach in jeder Art von Zytologie Probe (Pleuraerguss Vs. bronchiale waschen) oder Tumor-Histologie (Adenokarzinom Vs. Squamous Zelle Krebsgeschwür) mit einem ICC zwischen 0,82 und 0,96. Vergleicht man die PD-L1-TPS 37 (von 70) Paare zytologische Proben mit der LDT, die Biopsie-Proben mit den Goldstandard, die Konkordanz-Rate mit ≥1 % TPS oder ≥50 % TPS Punkt schneiden war mehr als 97 % und der ICC war zwischen 0,93 und 0,95.

Abbildung 1: Vertreter Färbung Muster auf Biopsie und Zytologie Proben mit 22 3 Antikörper-Konzentrat (LDT), verglichen mit der PD-L1-IHC 22 3 Kit (Goldstandard). (A) dieses Panel zeigt die PD-L1 IHC 22 3-Assay auf eine Tumor-Biopsie eingesetzt. (B) zeigt dieses Fenster die optimierte LDT mit 22 3 Antikörper-Konzentrat auf Schnittserien aus der gleichen Tumor-Biopsie, da im Panel Aanalysiert. (C) dieses Panel zeigt den PD-L1 IHC 22 3 Test in einem Zellenblock. (D) zeigt dieses Fenster die optimierte LDT mit 22 3 Antikörper konzentrieren sich auf Schnittserien aus der gleichen Zellenblock wie in Feld Canalysiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Wir haben eine optimierte LDT mit den 22 3 PD-L1-Antikörper-Konzentrat, durch den Vergleich mit den entsprechenden klinisch validierte kommerziellen Test^10,11validiert. Die 22 3 konzentriert Antikörper-basierten LDT zeigten eine hohe Übereinstimmung zwischen Biopsie (~ 100 %) und Zytologie (~ 95 %) Exemplare im Vergleich zu den PD-L1 IHC-Ausdruck mit Hilfe des PD-L1 IHC 22 3 Tests bei ≥1 % TPS und ≥50 % TPS Schnitt Punkte ermittelt. Wie vor kurzem empfohlen von der internationalen Vereinigung für das Studium von Lungenkrebs, die PD-L1 positive Bereiche sollte für ca. 10 PD-L1 negative Proben 10 PD-L1-positiven Proben und 20 Proben für den linearen dynamischen Bereich des gleich der klinisch validiert testen PD-L1 IHC⁸. Wir haben eine Validierungsstudie über 120 Biopsien und 70 zytologische Proben durchgeführt. Alles in allem war die Konkordanz hoch, unabhängig von der TPS cutoff für Positivität, die Art der Proben oder Tumor-Histologie. Die hier vorgestellten Ergebnisse sind in Übereinstimmung mit denen der anderen früheren Studien, die zeigen einer hohe Konkordanz für Gewebe und zytologische Proben^12,13,14,15.

In dieser Studie wurden die Proben in 10 % korrigiert NBF. Wir keine Bewertung der Auswirkungen der anderen Fixiermittel, während die Wirkung auf PD-L1 Färbung des anderen nicht-Formalin Fixiermittel wie Alkohol basierenden Fixiermittel ist derzeit unerforscht. Das Vorhandensein von Immunzellen, die mit dem Ausdruck PD-L1, besonders Makrophagen, sichert eine sorgfältige Auslegung der zytologische Präparate. Diese Proben müssen bewertet werden, unter Bezugnahme auf die serielle Hämatoxylin und Eosin schieben, und in einigen schwierigen Fällen ergänzende Flecken Immunzellen beurteilen können durchgeführt werden, um Fehlinterpretationen der PD-L1-Expression in Tumorzellen nur ausschließen.

Diese Studie enthält eine Reihe von Einschränkungen, einschließlich eine retrospektive Analyse an einer einzigen Institution, und die Tatsache, dass kein Patient mit Pembrolizumab das klinische Ergebnis auswerten behandelt wurde. Darüber hinaus präsentiert eine geringfügige Einschränkung der LDT hier Bedenken das körnige Färbung Muster, das beobachtet wurde, gelegentlich bei Verstärker-Systeme, die ihre Interpretation erschweren kann. Darüber hinaus ist das Färbung Muster von Immunzellen etwas intensiver als die mit dem Gold Standard beobachtet. Die Ausbildung von Pathologen ist notwendig, um eine korrekte Interpretation der PD-L1 mit IHC Beflecken zu erhalten. ¹⁶

In der klinischen Einstellung muss die Robustheit des LDTs im Laufe der Zeit durch Suche nach Zertifizierung und Akkreditierung von folgenden Standardarbeitsanweisungen und indem Sie regelmäßig an externen Bewertung Systeme⁸beibehalten werden. Die Garantie für die klinische Vorhersageleistung kann sichergestellt werden, nur dann, wenn diese Voraussetzungen erreicht⁸sind.

Das Protokoll hier vorgestellten Adressen die kritische Notwendigkeit für PD-L1 LDTs auf Biopsie und Zytologie Proben, wenn auf eine weithin verfügbar Autostainer aus geografischen Regionen analysiert, die nicht mit dem Gold-Standard-Assay ausgerüstet werden kann. Das hier vorgestellte LDT mit 22 3 Antikörper Konzentrat optimiert wurde, lässt sich der PD-L1-Ausdruck auf Biopsie und Zytologie Proben von NSCLC-Patienten ausgewertet. Dies wird deutlich erweitern die Anzahl der Laboratorien, die qualitativ hochwertige PD-L1 Tests zur Identifizierung von Patienten mit NSCLC anbieten können, die Anspruch auf Behandlung mit Pembrolizumab Monotherapie auf eine zuverlässige und reproduzierbare Weise.

Eine mögliche zukünftige Richtung soll die Machbarkeit der Verwendung anderer Probenarten Zytologie zu bewerten (z.B.Proben von fein-Nadel Biopsien, Bronchoskopie-geführte FNA endobronchiale Ultraschall-geführte FNA und bronchiale Bürsten) mit 22 3 Antikörper Konzentrat-basierte LDTs.

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Diese Studie wurde unterstützt von Merck & Co., Inc., Kenilworth, NJ, USA. Die Geldgeber spielte keine Rolle im Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung, zu veröffentlichen oder der Manuskripterstellung.