3 22 باستخدام الأجسام المضادة-PD-L1 تركز على خزعة وعينات عنق من مرضى سرطان الرئة من الخلايا غير الصغيرة

لتوسيع قدرة المختبرات في جميع أنحاء العالم لتقييم الأهلية للمرضى المصابين بسرطان الرئة للمعاملة مع بيمبروليزوماب، بطريقة موثوقة واستنساخه، قمنا بتطوير مقايسة يستخدم تركيز الضد 3 22 على نطاق واسع أوتوستاينير المناعي، لعينات خزعة وعلم الخلايا.

وافقت الأحادي بيمبروليزوماب لعلاج المرضى المصابين بسرطان الرئة الخلية غير الصغيرة PD-L1-الإعراب عن المتقدم (NSCLC) السطر الأول والثاني. إجراء اختبار للتعبير PD-L1 مع 3 22 رفيق PD-L1 إيمونوهيستوتشيميستري (المدينة) التشخيص المقايسة، الذي يعطي نسبة ورم نقاط (TPS)، وقد صودق على أنسجة الورم. لقد طورنا أمثل تطوير مختبر تجربة (LDT) يستخدم الركاز 3 22 جسم (Ab) في أوتوستاينير المدينة متاحة على نطاق واسع لعينات خزعة وعلم الخلايا. تم تقييم مع 120 أبواب إقران كل ورم الأنسجة وعينات خزعة TPS PD-L1 ومع 70 إقران عينات خزعة وعنق (يغسل الشعب الهوائية، n = 40؛ الاراقة الجنبي، ن = 30). قص Ab 3 22 LDT المستندة إلى التركيز أظهرت ارتفاع معدل التوافق بين خزعة (~ 100%)، وعلم الخلايا العينات (~ 95 ٪) بالمقارنة مع "المدينة" PD-L1 التعبير المحدد باستخدام مقايسة رفيق 3 22 PD-L1 "المدينة" في كل النقاط النقاط (% إيه وان، إيه فايف زيرو %). وستوسع LDT الأمثل المعروضة هنا، باستخدام تركيز Ab 3 22 لتحديد التعبير PD-L1 في كلا ورم الأنسجة وعينات عنق، قدرة المختبرات في جميع أنحاء العالم لتقييم أهلية مرضى NSCLC للعلاج مع بيمبروليزوماب الأحادي بطريقة موثوقة واستنساخه.

وقد أظهرت التجارب السريرية الأخيرة كفاءة بيمبروليزوماب، أنسنة [مونوكلونل] IgG4 كابا ايستب جسم الذي يمنع التفاعل بين موت الخلايا المبرمج 1 (PD-1)، وأن يغاندس، PD-L1 و PD-L2، في علاج المرضى الذين يعانون من متقدمة NSCLC^1،2،،من³⁴.

حاليا، هو الموافقة على بيمبروليزوماب المعاملة للإعراب عن PD-L1 NSCLC في كلا المرضى العلاج-السذاجة مع تعبير PD-L1 TPS إيه فايف زيرو % ولا من مستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR) أو الأورام اللمفاوية المتحولة كيناز (ALK) الورم الجينوم الانحرافات³ وعن سبق تعامل المرضى مع TPS PD-L1 إيه وان %¹.

تعبير البروتين PD-L1 الكشف عنها بواسطة المدينة قد استخدمت على نطاق واسع من وصفها فحص العلامات البيولوجية تنبؤية للعلاجات المضادة-PD-1/PD-L1. في التجارب السريرية بيمبروليزوماب، مصممة TPS PD-L1 الحصول عليها مع الفورمالين--الثابتة جزءا لا يتجزأ من البارافين (FFPE) عينات الأنسجة باستخدام مقايسة رفيق PD-L1 "المدينة" 22 3⁵. هذا التحليل قد أقرها "لنا الغذاء" والدواء (FDA)، وقد تم وضع علامة CE في أوروبا لتحديد الورم TPS PD-L1⁵.

خيارات عالمية إضافية عبر المؤسسات لتقييمات موثوقة وعالية الجودة من TPS PD-L1 مع LDTs الذي استخدم تركيز الضد 22 3 ضرورية لدعم اتخاذ القرارات السريرية فيما يتعلق بأهلية المريض بيمبروليزوماب العلاج. عدد كبير من مختبرات علم الأمراض لا يحصلون على مقايسة PD-L1 "المدينة" 3 22 التشخيص رفيق. ولذلك، ضروري وضع LDTs موثوقة ومتسقة متوافقة مع منصات أوتوستاينير إضافية، ومتاحة على نطاق واسع في المدينة.

وعلاوة على ذلك، هناك حاجة إلى إنشاء LDTs باستخدام عينات الخلايا التي هي نوع العينة الوحيدة المتاحة كثيرا من مرضى NSCLC. التحقق من صحة المقايسة رفيق PD-L1 "المدينة" 3 22 ريسيكشنز وكور إبرة الخزعات، ويقوم إلا إذا كان القصبات غلة 100 ورم الخلايا. على الرغم من أن كثيرا ما يتم الحصول على أنواع العينات المذكورة أعلاه، عينات الخلايا التي تم جمعها بسهولة أكبر وهي نوع العينة المتاحة الأكثر شيوعاً في بعض المؤسسات^6،7. ومع ذلك، هناك لا فحص التشخيص تم التحقق من صحتها المتاحة حاليا لتقييم التعبير PD-L1 في عينات عنق؛ LDTs موثوقة متوافقة مع عينات عنق ستيسر اختبار PD-L1 عالية الجودة.

وعلاوة على ذلك، عند وضع المصادقة LDT السريرية، ينبغي أن يجري في المدينة بطريقة مشابهة ل اختبار التجاري المصادق عليه سريرياً الموافق⁸. على سبيل المثال، ينبغي التحقق من عدة خطوات حاسمة للحصول على إشارة نفسه في مقاطع المسلسل مثل معايرة الأجسام المضادة وتأخير المعالجة المسبقة ووقت الحضانة و نظم التضخيم⁹.

ونحن مؤخرا بوضع LDT أمثل الذي يستخدم تركيز الضد 3 22 لتقييم التعبير PD-L1 في ورم الخزعات وعنق عينات^10،11. يمكننا العثور على الفهرس أبجدي عالية مع LDT مقابل "المعيار الذهبي" المدينة PD-L1 3 22 مقايسة^10،11. سوف تدعم هذا البروتوكول سريرياً المصادق عليها موثوقة وعالية الجودة PD-L1 اختبار مختلف المناطق على الصعيد العالمي.

جميع إجراءات أقرتها لجنة الأخلاقيات المحلية (البشرية لجنة أخلاقيات البحوث، المركز الاستشفائي الجامعي دي نيس/Tumorothèque BB-0033-00025).

ملاحظة: هذا البروتوكول تحديداً يعدل لاستخدام التركيز جسم 3 22 على الملطخ المدينة الآلي متاحة تجارياً (يشار إليها أوتوستاينير هنا، انظر الجدول للمواد) لعينات الخلايا وورم الخزعات.

1-إعداد عينات الأنسجة السرطانية

1. إصلاح الأنسجة السرطانية في 10% فورمالين مخزنة محايدة (NBF) في كاسيت.
   ملاحظة: ورم الأنسجة من أورام الرئة الدانية عموما الحصول على طريق القصبات، يؤديها الأمراض الصدرية، أو أخصائي الرئة تحت التخدير المعتدل. للآفات الطرفية وأمراض الرئة منتشر، يشار إلى خزعة ترانسبرونتشيال أو إبرة. وعادة ما تتم هذه الإجراءات في غرفة عمليات جراحية أو وحدة العناية المركزة.
2. تضمين في الكاسيت في البارافين.
   ملاحظة: التثبيت يمكن تحقيقه نضح أو الغمر فورا عقب التشريح، وعادة ما يتطلب ح 8 – 10. وينبغي أن يكون حجم مثبت 15 – 20 x أكبر من حجم العينة. لا ينصح لإصلاح الأنسجة خزعة لأكثر من 10 ح، لأنه يمكن أن يسبب أوفيرفيكسيشن إخفاء للمستضد. سرعة التثبيت حوالي 1 مم/ساعة في درجة حرارة الغرفة.
3. التسلل عينة الأنسجة الثابتة بالشمع في المعالج الأنسجة (انظر الجدول للمواد).
   ملاحظة: يتم الجفاف في ثلاثة حمامات الكحول مع زيادة تركيزات 70%، 85% و 90%. أخيرا يتم إزالة المياه بواسطة ثلاثة حمامات نهائي مطلق الكحول. يتم إجراء تطهير في ثلاثة حمامات والتولوين، وتسلل الشمع في حمامات الشمع الساخن (44 – 60 درجة مئوية).
4. تضمين الأنسجة داخل العفن مليئة البرافين المنصهر (انظر الجدول للمواد)، والانتظار للتجميد.
5. قسم الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين في سمك 3 ميكرومتر في مبضع.
6. نقل الشرائح الشريط البارافين لزجاج مجهر مشحونة بشكل إيجابي (انظر الجدول للمواد).
7. الجاف للشريحة ح 1 في 37 درجة مئوية.
   ملاحظة: تخزين المقاطع الأنسجة في 2 – 8 درجة مئوية (يفضل) أو في درجة حرارة الغرفة يصل إلى 25 درجة مئوية الحفاظ على أنتيجينيسيتي، ووصمة عار داخل 15 د لتمزيقها.

2-إعداد عينات عنق

1. جمع الغسالات الشعب الهوائية في حل حافظة (انظر الجدول للمواد).
   ملاحظة: لهذا، يتم استخدام تقنية القصبات القياسية.
   1. الغسل توزيع القصبات الهوائية أخذ عينات. جمع الغسيل في حاوية نظيفة. التسمية الحاوية مع المريض الأول واسم العائلة، تاريخ الميلاد، ومصدر العينة.
2. نقل الغسالات الشعب الهوائية إلى أنبوب مخروطي 50 مل وإضافة 2 غ ديثيوثريتول دل مسحوق (انظر الجدول للمواد)، دوامة الأنبوب لمدة 30 دقيقة ومن ثم الطرد المركزي في 250 x ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
3. إزالة المادة طافية وإضافة 10 مل حل موكوليتيك (انظر الجدول للمواد).
4. هزة العينة لمدة 20 دقيقة بسرعة متوسطة (المستوى 9) والطرد المركزي أنه في 250 x g لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
5. إزالة المادة طافية وإيداع بيليه الخلية في أنابيب مجموعة التي تحتوي على 10% NBF.
6. إضافة 4 قطرات كاشف إعداد كتلة الخلية (انظر الجدول للمواد) إلى بيليه الخلية.
7. نقل الخلية بيليه إلى كاسيت، وإصلاحه في 10% NBF, البارافين-تضمين وذلك لإعداد كتلة الخلية وتمزيقها (انظر الخطوات 1.1-1.7).

3. PD-L1 تلطيخ الإنزيم

1. قم بالتبديل أوتوستاينير والكمبيوتر.
2. انقر نقراً مزدوجاً فوق الرمز أوتوستاينير واختيار المستخدم.
3. انقر على 'إنشاء تسمية' ، ثم على 'بروتوكول'.
4. انقر نقراً مزدوجاً فوق البروتوكول 3 22.
   ملاحظة: مثبت البروتوكول أولاً على الكمبيوتر أوتوستاينير بالنقر فوق 'إنشاء بروتوكول'. وتقدم في بروتوكول كامل التكميلية الملف 1.
5. اكتب معرف المريض في التسمية، ثم انقر فوق 'طباعة'.
6. عصا التسمية على الشريحة.
7. فتح درج الشريحة عن طريق الضغط على الزر للساحب الذي تم اختياره.
8. ضع الشريحة المسماة على لوحة الحرارية مع التسمية التي تواجه أعلى وإلى الداخل.
9. قم بإغلاق درج الشريحة.
10. إزالة القبعات من الصيادلة وتحميل الكواشف على رفوف الكواشف.
11. فتح غطاء محرك السيارة الملطخ ووضع الرفوف على فرسان الكواشف للتأكد من أنها تناسب وعقد في الموقف.
12. أغلق غطاء محرك السيارة.
13. في البرنامج، انقر على الصك الذي سيتم استخدامه، وانقر فوق 'تشغيل'.
14. في نهاية هذا الإجراء المدينة، شطف الشريحة لعدة ثوان بماء الصنبور وقطره واحدة من محلول التنظيف.
15. ترطيب الشريحة مع حمام واحد من الإيثانول 100% وحمام ثانية من الإيثانول 95% لعدة ثوان.
16. ضع الشريحة في الجهاز كوفيرسليبينج التحميل الآلي ساترة.

4-الترجمة الشفوية من تلطيخ PD-L1

ملاحظة: يجب إجراء أخصائي مؤهل تفسير الاختبار "المدينة" PD-L1.

1. تقييم جودة PD-L1 تلطيخ بتحليل عناصر إيجابية وسلبية قبل فحص العينة للمريض.
   ملاحظة: تعتبر النتائج التي تم الحصول عليها على عينة للمريض غير صالح إذا كان تلطيخ عناصر التحكم غير مقبول.
2. تأكيد وجود حد أدنى من 100 الخلايا السرطانية قادرة على البقاء تحت مجهر.
   ملاحظة: التقرير عندما يكون العينة في المريض أقل من 100 ورم الخلايا.
3. في تكبير منخفض من 4 X، تقييم جميع مجالات الحفاظ عليها جيدا الورم الإيجابية والسلبية.
   ملاحظة: في تكبير منخفضة، يلطخ الغشاء الجزئي أو الغشاء تلطيخ كثافة ضعيفة (1 +) قد يكون من الصعب الاعتراف.
4. نقاط تلطيخ غشاء الخلية كاملة أو جزئية.
   ملاحظة: تلطيخ هيولى له مستبعدين من التفسير.
5. حساب النقاط التجارية بتقدير نسبة PD-L1 الخلايا السرطانية إيجابية بالنسبة لجميع الخلايا السرطانية موجودة في مناطق الورم يتم الحفاظ عليها جيدا.
   ملاحظة: ينبغي فحص الخلايا السرطانية قابلة للتطبيق فقط. جميع العناصر الخلوية الأخرى، مثل الخلايا المناعية، نخرية الخلايا والخلايا الطبيعية والتحف، يجب أن تستبعد من الفحص.

استخدام الإجراء المعروضة هنا، وعلى النحو المبين بالتفصيل في هذه المجموعة الأخيرة منشورات^10،11، صدق LDT الأمثل سريرياً مع 120 FFPE NSCLC المحفوظات خزعة عينات أخذت من المرضى الذي خضع لجراحة بتر أو خزعة في مستشفى الجامعة باستور، نيس، بين آذار/مارس 2007 وآذار/مارس عام 2016. وعلاوة على ذلك، لتقييم التعبير PD-L1 لعينات الخلايا، تم تقييم النقاط التجارية في 70 عينات خزعة النسيج المزدوجة وكتل الخلايا التي تم إعدادها من يغسل الشعب الهوائية (n = 40) أو الاراقة الجنبي (ن = 30) (التي تم جمعها في باستور المستشفى الجامعي، نيس، بين تموز/يوليه عام 2014 و 2016 تشرين الثاني/نوفمبر). قطع كافة الشرائح الطازجة والملون في غضون 24 ساعة.

ممثل تلطيخ نمط مع خزعة عينات استخدام جسم 3 22 الركاز (LDT)، بالمقارنة مع المقايسة رفيق PD-L1 "المدينة" 3 22 (معيار الذهب) ويرد في الشكل 1A و 1B. استخدام TPS % إيه وان، كانت حالات 54/120 (45 في المائة) PD-L1 إيجابيا، أثناء استخدام TPS % إيه فايف زيرو، حالات 29/120 (24%) واعتبرت إيجابية ل PD-L1.

وكان معامل الارتباط تم (المحكمة الجنائية الدولية) المستخدمة لقياس العلاقة بين درجة TPS كمتغير مستمر 99% بين في LDT ومعيار الذهب. باستخدام كل النقاط التجارية قطع النقاط إيه وان % وإيه فايف زيرو %، عشرات κ لاتفاق إينتيرباثولوجيست تساوي 1 ضمن منهاج LDT.

ممثل تلطيخ نمط مع عنق العينات باستخدام جسم 22 3 تركز على LDT مقارنة مع عدة PD-L1 "المدينة" 3 22 (معيار الذهب) يرد في الشكل 1 ود 1. خفض معدل 70 زوجاً من عينات خزعة وعلم الخلايا مع LDT أيا من النقاط باستخدام الفهرس الأبجدي نقطة % إيه وان وكان أكبر من 95%، والمحكمة الجنائية الدولية باستخدام نقاط TPS كما كان متغير مستمر بين 0.88 و 0.90% إيه فايف زيرو. يتسق هذا الاستنتاج عبر كل نوع من عينة عنق (الانصباب الجنبي vs. يغسل الشعب الهوائية) أو ورم الأنسجة (غدية مقابل. الخلايا الحرشفية) مع محكمة جنائية دولية بين 0.82 و 0.96. عند مقارنة TPS PD-L1 من 37 (من أصل 70) أزواج من عينات عنق مع LDT عينات خزعة مع معيار الذهب، معدل التوافق باستخدام % إيه وان النقاط أو النسبة المئوية إيه فايف زيرو TPS قطع نقطة كانت أكبر من نسبة 97% والمحكمة الجنائية الدولية بين 0.93 و 0.95.

رقم 1: الممثل تلطيخ نمط على عينات خزعة وعلم الخلايا استخدام مركزات جسم 3 22 (LDT)، مقارنة مع "المدينة" PD-L1 3 22 طقم (معيار الذهب)- (أ) هذا الفريق يظهر الإنزيم PD-L1 "المدينة" 22 3 المستخدمة في خزعة ورم. (ب) يظهر هذا الفريق LDT الأمثل استخدام مركزات جسم 3 22 على مقاطع المسلسل من خزعة الورم نفسه كما حللت في الفريق A. (ج) هذا الفريق يظهر التحليل PD-L1 "المدينة" 3 22 في كتلة خلية. (د) يظهر هذا الفريق LDT الأمثل باستخدام جسم 22 3 التركيز على مقاطع المسلسل من كتلة الخلية نفسها كما حللت في لوحة ج. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

ونحن قد التحقق من صحة LDT أمثل استخدام تركيز الضد PD-L1 3 22, بمقارنته مع ال^10،اختبار التجاري المصادق عليه سريرياً المقابلة¹¹. 3 22 تتركز LDT المستندة إلى جسم أظهرت ارتفاع معدل التوافق بين خزعة (~ 100 ٪) وعينات عنق (~ 95 ٪) عند مقارنتها بتعبير "المدينة" PD-L1 تحدد باستخدام مقايسة PD-L1 "المدينة" 3 22 في إيه وان % TPS و % إيه فايف زيرو TPS قطع النقاط. كما أوصت مؤخرا "الرابطة الدولية" "دراسة سرطان الرئة"، ينبغي أن تكون مجالات إيجابية PD-L1 نفسها بالنسبة لحوالي 10 عينات سلبية PD-L1، 10 عينات إيجابية PD-L1 و 20 عينات تغطي النطاق الديناميكي الخطي التحقق من صحة سريرياً اختبار "المدينة" PD-L1⁸. أجرينا دراسة التحقق من صحة في خزعات 120 و 70 عينات الخلايا. وعموما، كان التوافق عالية، مستقل عن TPS استقطاع للايجابية، ونوع العينات، أو ورم الأنسجة. النتائج المعروضة هنا الاتفاق مع تلك التي لغيرها من الدراسات السابقة تبين ارتفاع معدل التوافق للأنسجة والخلايا العينات^12،،من^1314،15-

في هذه الدراسة، تم إصلاح جميع العينات في 10% NBF. ونحن لم يقيم أثر أخرى نسيجية، بينما أثر على تلطيخ PD-L1 لأخرى نسيجية غير الفورمالين المصفف المستندة إلى الكحول حاليا غير مستكشفة. وجود الخلايا المناعية معربا عن PD-L1، لا سيما الضامة، أوامر إلى تفسير دقيق لعينات الخلايا. يجب أن يتم تقييم هذه العينات فيما يتعلق الهيماتوكسيلين المسلسل والشريحة ثم، وفي بعض الحالات الصعبة، يمكن أداؤها البقع مكملة لتقييم الخلايا المناعية لاستبعاد أي تفسير التعبير PD-L1 في الخلايا السرطانية فقط.

وتحمل هذه الدراسة عددا من القيود، بما في ذلك تحليل استعادي في مؤسسة واحدة، وحقيقة أن يعامل أي مريض مع بيمبروليزوماب لتقييم النتائج السريرية. وباﻹضافة إلى ذلك، قيداً طفيفة LDT المعروضة هنا المخاوف نمط المصبوغة الحبيبية الذي لوحظ في بعض الأحيان عند استخدام نظم التضخيم، الذي قد يزيد من صعوبة تفسيرها. وعلاوة على ذلك، نمط الخلايا المناعية المصبوغة نوعا ما أكثر كثافة من أنه لاحظ مع معيار الذهب. تدريب أخصائيي علم الأمراض من الضروري الحصول على تفسير صحيح لتلطيخ PD-L1 مع المدينة. ¹⁶

في الإعداد السريرية، يلزم متانة LDTs الحفاظ على مر الزمن بالسعي إلى منح الشهادات والاعتماد وإجراءات التشغيل الموحدة التالية، وتشارك بانتظام في مخططات تقييم الجودة الخارجي⁸. ويمكن ضمان ضمان أداء التنبؤية السريرية فقط عند هذه الشروط هي إنجاز⁸.

عرض البروتوكول هنا عناوين الحاجة الماسة إلى LDTs PD-L1 في عينات خزعة وعلم الخلايا عند تحليلها على أوتوستاينير متاحة على نطاق واسع عبر المناطق الجغرافية التي قد لا تكون مجهزة بمقايسة معيار الذهب. LDT المعروضة هنا، التي كان الأمثل باستخدام مركزات جسم 3 22، يمكن استخدامها لتقييم التعبير PD-L1 في عينات خزعة وعلم الخلايا من مرضى NSCLC. هذا سوف توسع إلى حد كبير عدد المختبرات التي يمكن أن توفر جودة عالية PD-L1 اختبار لتحديد مرضى NSCLC الذين مؤهلة للحصول على العلاج مع بيمبروليزوماب الأحادي، بطريقة موثوقة واستنساخه.

اتجاه المستقبلية محتملة لتقييم جدوى استخدام أنواع العينات الخلايا الأخرى (مثلاً، عينات من اندوبرونتشيال غرامة إبرة الخزعات، تسترشد القصبات جامع الفناء، الموجات فوق الصوتية الموجهة بجامع الفناء، وفرش الشعب الهوائية) مع جسم 3 22 LDTs المستندة إلى التركيز.

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

أشرفت على هذه الدراسة من شركة ميرك & Co., Inc.، كينيلورث، نيوجيرسي، الولايات المتحدة الأمريكية. الممولين أي دور في تصميم الدراسة، وجمع البيانات وتحليل، وقرار نشر أو إعداد المخطوطة.