In Situ Messung und Korrelation der Zelldichte und Lichtemission von Biolumineszenten Bakterien

Biolumineszente Bakterien regulieren Licht Produktion durch eine Vielzahl von Mechanismen, wie z. B. Quorum sensing. Diese neuartige Methode ermöglicht die in Situ -Untersuchung von Biolumineszenz und die Korrelation der Lichtemission, Zelldichte. Eine künstliche Biolumineszenz Escherichia coli System ermöglicht die Charakterisierung des Lux -Operons, Lux Proteine und deren Zusammenspiel.

Es gibt eine beträchtliche Anzahl von Bakterienarten Licht emittieren. Sie alle teilen die gleiche gen-Cluster, nämlich die Lux Operon. Trotz dieser Ähnlichkeit zeigen diese Bakterien extreme Schwankungen in Eigenschaften wie wuchsverhalten, Intensität der Lichtemission oder Regulierung der Biolumineszenz. Die hier vorgestellte Methode ist ein neu entwickeltes Assay, der Aufnahme von Zellwachstum und biolumineszenten Lichtemission Intensität im Laufe der Zeit unter Verwendung eines Platte Lesers kombiniert. Die daraus resultierende Wachstum und Lichtemission Merkmale können auf wichtige Merkmale der jeweiligen Bakterienstamm, z. B. Quorum-sensing-Regelung verknüpft werden. Der Anbau einer Reihe von biolumineszenten Bakterien erfordert ein spezifisches Medium (z. B. künstliche Meer Wasser Medium) und definiert Temperaturen. Die einfach zu handhaben, nicht-biolumineszenten Standard-Forschung Bakterium Escherichia coli (E. Coli), können auf der anderen Seite kostengünstig in hohen Stückzahlen im Labormaßstab kultiviert werden. Nutzung von E. Coli durch die Einführung einer Plasmid enthält das gesamte Lux Operon Versuchsbedingungen zu vereinfachen und zusätzlich eröffnet viele Möglichkeiten für zukünftige Anwendungen. Der Ausdruck aller Lux Gene unter Verwendung einer E. Coli Ausdruck Belastung erzielte Bau ein expressionsplasmid über Gibson Klonen und Einfügung von vier Fragmente mit sieben Lux Gene und drei Rippe Gene die Lux-Rib -Operon in einen pET28a-Vektor. E. Coli basierte Lux Genexpression induziert und über Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranosid (IPTG) Addition führt Biolumineszenz E. Coli gesteuert werden kann Zellen. Die Vorteile dieses Systems sind zu vermeiden, Quorum-sensing-Verordnung Beschränkungen und komplexe mittlerer Kompositionen zusammen mit nicht standardmäßigen Wachstumsbedingungen, wie z. B. Temperaturen definiert. Dieses System ermöglicht die Analyse von Lux -Genen und deren Zusammenspiel, durch den Ausschluss des jeweiligen Gens aus der Lux Operon oder sogar Zugabe von neuartigen Genen, den Austausch der LuxAB Gene von einem Bakterienstamm durch ein anderes, oder Analyse von Protein-komplexe, z. B. LuxCDE.

Die Emission von Licht durch lebende Organismen (Biolumineszenz) ist ein faszinierender Prozess, die in Bakterien, Pilze, Insekten, Nematoden, Fische und Tintenfische¹gefunden. Biolumineszenten Lichtemission ergibt sich aus einem Chemolumineszenz Reaktion in die chemischer Energie in Lichtenergie ("kaltes Licht") (teilweise) umgewandelt wird. Bei biolumineszenten Bakterien katalysiert die heterodimerisierenden Enzym Luciferase Monooxygenation von langkettigen aliphatischen Aldehyde, wie z. B. Tetradecanal, um die entsprechenden Säuren begleitet von Lichtemission mit einem Maximum an 490 nm^{2, 3}.

Abbildung 1 : Allgemeine Reaktionsschema der bakterielle Luciferase. Die bakterielle Luciferase (LuxAB) katalysiert die Monooxygenation von langkettigen Aldehyden (CH₃(CH₂)_nCHO) durch den Einsatz reduziert Flavin mononukleotid (FMNH₂) und molekularer Sauerstoff (O₂), wodurch die Produkte lange Kette Säuren (CH₃(CH₂)_nCOOH), Flavin mononukleotid (FMN), Wasser (H₂O) und die Emission von Licht zentriert auf 490 nm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Bei dieser Oxidation freiwerdende Energie bewirkt einen angeregten Zustand FMN-4a-Hydroxid, dient als die Licht emittierende Luciferin⁴. Die Proteine, die im bakteriellen Biolumineszenz, nämlich LuxCDABEG, von Lux Operon codiert sind und sind über verschiedene Bakterienstämme^2,5hoch konserviert. Die Gene LuxA und LuxB kodieren für die Luciferase heterodimerisierenden; LuxC, LuxD desund LuxE Genprodukte sind Bestandteil einer Fettsäure-Reduktase Komplex; und LuxG kodiert für eine Flavin-Reduktase-⁶. Das zusätzliche LuxF Gen tragen eine Reihe von Biolumineszenz Photobacteria (e.g.,Photobacterium Mandapamensis 27561). Es wurde berichtet, dass LuxF ist ein Homodimeric Protein, das die ungewöhnliche Flavin Derivat 6-(3'-(R)-Myristyl bindet)-FMN (MyrFMN)^{7,8,9,10,11 ,12}. Weitere Gene identifiziert worden, die verantwortlich sind für die Synthese von Riboflavin (z. B. RibEBH) und außerdem regulatorische Gene berichtet worden, dass eine Rolle bei Quorum sensing Regelung der Biolumineszenz, vor allem für Vibrio Fischeri und Vibrio Harveyi^6,13. Trotz der hoch konservierte gen Reihenfolge zeigen biolumineszente Bakterien hohe Temperaturschwankungen in Eigenschaften wie wuchsverhalten, Intensität der Lichtemission oder Regulierung der Biolumineszenz^2,5,14 .

Mehrere Stämme oder Plasmide enthalten Teile geändert oder ganze Lux -Operons bekannt sind, nutzen Biolumineszenz als Reporter-Systeme. Verschiedene Anwendungen wie z. B. die Bestimmung promotoraktivität, Überwachung von bakterieller Kontaminationen in Umgebung oder Lebensmittelproben, Biolumineszenz Resonanz Energie Transfer (BRET), in-Vivo Bildgebung von Infektionen in Eukaryonten, pyrosequenzierung usw. waren etablierte^15,16,17. Interessant ist, verwendeten die drei am häufigsten Biolumineszenz Reporter, die Systeme von der nordamerikanischen Firefly (Photinus Pyralis), der magensaftresistenten Erreger von Nematoden (Photorhabdus Luminescens) und das Meer Stiefmütterchen (Renilla abgeleitet werden Reniformis). Keines dieser Systeme hat einen bakteriellen Ursprungs, aber die Nutzung von Lux -Genen und Operons bakterieller Herkunft gewinnt mehr Interesse für angewandte Forschung¹⁶. Die weniger reichliche Anwendung der Biolumineszenz Proteine aus bakteriellen Quellen ist hauptsächlich auf geringere Stabilität und Langlebigkeit der Bakterien abgeleitet leuchtende Proteine bezogen auf ihre marinen Lebensräumen. Biolumineszente Bakterien mariner Lebensräume sind nicht unter standard Laborbedingungen kultivierbar. Diese Bakterien benötigen spezifische Wachstumsmedien und Bedingungen, wie künstliche Meer mittleren und unteren Wachstum/Inkubation Wassertemperaturen (z. B. 28 ° C).

Zur Vereinfachung der Vergleich von Lux Operon Merkmale oder einzelne Lux Gene einer Reihe von verschiedenen biolumineszenten Bakterienstämme, eine Methode, um Lux Operon Ausdruck und Analyse zu standardisieren ist Voraussetzung. So entstand die Idee das gesamte Lux-Rib -Operon in der Standard-Forschung-Bakterium Escherichia coli (E. Coli) zu integrieren. Zu diesem Zweck Gibson Montage erwies sich als ein nützliches Werkzeug, um mehrere lineare, überlappende Fragmente in einem Expressionsvektor ohne die Notwendigkeit einer spezifischen Restriktionsschnittstellen zu integrieren. Diese Methode ist auch geeignet, wenn DNA-Einsätze zu groß sind (e.g.,P. Mandapamensis 27561 LuxCDABFEG RibEBH; ~ -9 kb-Operon-Größe), über PCR verstärkt werden. Ein Lux Operon kann in mehrere überlappende Fragmente getrennt werden, dann in einem expressionsplasmid zusammengebaut werden und schließlich die Reihenfolge überprüft Montage Produkt kann direkt in eine entsprechende E. Coli umgewandelt werden-System für high-Yield Protein Ausdruck^18,19,20. Neben der leicht zu handhaben E. Coli basierte Lux Genexpression blieb eine einfache Methode, die Aufnahme von Zellwachstum und biolumineszenten Lichtemission Kombination hergestellt werden. Die hier beschriebene Methode ermöglicht die in Situ Messung und Korrelation der Zelldichte und Lichtemission von biolumineszenten Bakterien.

Die Analyse der Lux Gene und Lux Operon Ordnung und Regulation von verschiedenen biolumineszenten Bakterien mit, auf der einen Seite, eine künstliche Biolumineszenz E. Coli enthält das gesamte Lux-Rippe Operon von P. Mandapamensis 27561 und auf der anderen Seite, eine neu entwickelte Platte Leser Assay kombiniert die in Situ -Aufzeichnung der Zelldichte und Lichtemission, hilft, um weitere Informationen zu den verschiedenen bakteriellen Lux -Systemen zu gewinnen. Diese grundlegenden Charakterisierung und Vergleich von Luciferases und verwandte Enzyme führen zu Alternativen zu den bereits etablierten Reporter-Systemen mit verbesserter Stabilität und Aktivität.

1. Entwurf, Erstellung und Ausdruck von Lux Operon in Escherichia coli

Hinweis: Weitere Informationen zu kommerziellen Kits, die in diesem Abschnitt verwendeten Tabelle der Materialien .

1. Wählen Sie für die Übertragung von Lux Operon in E. Coli einen standard Haustier Vektor mit entsprechenden Restriktionsschnittstellen und Antibiotikaresistenz-gen des Interesses (z. B. pET28a; NcoI, XhoI, Kanamycin).
2. Die Fragmente zu entwerfen und überlappende Zündkapseln für Gibson Montage anhand der DNA-Sequenz des Photobacterium Mandapamensis 27561 (GenBank: DQ988878.2).
3. Einrichten einer standard PCR-Reaktion mit der gestalteten Grundierungen und die isolierte genomische DNA Photobacterium Mandapamensis 27561 als Vorlage (siehe Zusatzmaterial für Grundierungen und Bedingungen).
   Hinweis: Isolierung der genomischen DNA des jeweiligen Bakterienstamm erhöht PCR Wirksamkeit.
4. Reinigen Sie das PCR-Produkt über Spin-Spalte Reinigung.
5. Durchführen Sie eine Beschränkungsverdauung des isolierten pET28a Vektors mit NcoI und XhoI bei 37 ° C für 45 min..
6. Reinigen des linearisierten Vektors und der PCR-Fragmente über Agarose gel Elektrophorese und anschließenden Spin-Spalte Reinigung.
7. Bestimmen Sie die DNA-Konzentration von Fragment und der linearisierten Vektor und berechnen Sie die optimalen Mengen für die Montage entsprechend der Protokoll-^20,-²¹.
   Hinweis: Wirksamkeit der Versammlung Fragmentgröße und Anzahl abhängig und muss gemäß des Herstellers Protokoll^20,21angepasst werden.
8. Brüten Sie nach Kombination alle Fragmente und der Puffer in einem PCR-Röhrchen die Montage-Mischung in einer PCR-Maschine bei 50 ° C für 1 h.
9. Gefertigten Produktes Vektor nach standard Transformation Protokolle für E. Coli Bakterien Plasmid Umwandlung in einen entsprechenden E. Coli zu verwandeln-System für high-Yield-Plasmid-Replikation (z. B. E. Coli TOP10 (oder XL-1).
10. Wählen Sie aus der Transformation Platte und Streifen auf neue Platten für die DNA-Isolierung Kolonien.
11. Plasmid-DNA nach Standardprotokollen zu isolieren.
12. Überprüfen Sie die korrekte Montage des Plasmids einschließlich alle Fragmente, führen Sie zuerst eine Kolonie-PCR nach Standardprotokolle mit Primer spezifisch für jedes montierte Fragment.
13. Zusätzlich zu der Kolonie PCR und nachfolgende Agarose-Gelelektrophorese, bereiten Sie alle isolierten Montage Vektoren für die DNA-Sequenzierung, die fachgerechte Montage und die korrekte DNA-Sequenzen zu überprüfen.
14. Transformieren der verifizierte Plasmid gemäß standard Transformation Protokolle für E. Coli Bakterien Plasmid Umwandlung in einen entsprechenden E. Coli System für high-Yield-Protein-Produktion (e.g.,E. coli BL21).
    Hinweis: Fahren Sie direkt mit Ausdruck Protokoll unten. Bei längerer Lagerung empfiehlt sich die Erstellung einer Glycerin-Aktie.

(2) Ausdruck der veränderten E. Coli -Stämme

1. Ausdruck eine Übernacht-Kultur (ONC) vorbereiten, durch Inokulation von einem entsprechenden Volumen der LB-Medium (z. B. 100 mL) mit dem vorbereiteten Glycerin bestand der E. Coli BL21 Zellen umgewandelt mit dem montierten Plasmid oder direkt von einem Transformation-Platte. Hinzufügen von 100 µL Kanamycin (50 mg/mL; Antibiotikaresistenz-gen des pET28a) und inkubieren Sie ONC bei 37 ° C und 120 u/min in einem Inkubator-Shaker über Nacht.
2. Die wichtigsten Ausdruck Kultur (z. B. 800 mL LB-Medium) mit 8 mL ONC impfen und 800 µL Kanamycin (50 mg/mL) hinzufügen.
3. Die wichtigste Kultur bei 37 ° C und 120 u/min in einem Inkubator-Shaker inkubieren, bis die Zelldichte eine OD₆₀₀ von 0,6 erreicht - 0,8 (ca. 2,5 h).
4. Reduzieren Sie die Inkubationstemperatur auf 28 ° C.
5. Proteinexpression durch Zugabe von IPTG in einer Endkonzentration von 0,1 mM zu induzieren.
   Hinweis: Empirische Tests zeigten, dass die Reduzierung der Temperatur auf 28 ° C die höchste Lichtstärke gab.
6. Zellen zu beobachten, bis sie anfangen zu leuchten (ca. 1 h).
   Hinweis: Je nach Zweck des Ausdrucks, die Zellen werden bis zum nächsten Tag angebaut und dann geerntet werden, oder die Zellen können gehalten, schütteln, solange sie (max. 48 h) Leuchten. Ernte der Zellen und Reinigung Proteine kann nach Standardverfahren erfolgen.

3. Ausdruck der Biolumineszenz Bakterienstämme

Hinweis: Biolumineszenz Bakterienstämme erfordern spezifische Medium/künstliche Meer Wasser Wachstumsmedium für Wachstum und leichte Produktion.

1. Künstlicher See Wasser Medium, bestehend aus zwei separat bereit mittelkomponenten vorzubereiten.
   Hinweis: Die Vorbereitung des Mediums künstliche Meer Wasser wurde aus dem ursprünglichen Protokoll²²angepasst. Folgende Beträge sind für flüssige Medium 1 L oder 1 L Agar Medium.
   1. Für künstliche Meer Wasser Medium, wiegen die folgenden Salze: 28,13 g NaCl, 0,77 g KCl, 1,60 g CaCl₂ · 2H₂O, 4,80 g MgCl₂ · 6H₂O, 0,11 g Nahco3₃und 3,50 g MgSO₄ · 7H₂O.
   2. 1 L destilliertes Wasser hinzufügen und alle Komponenten auflösen.
   3. Für LB-Medium, wiegen die folgenden Zutaten: 10 g Hefe-Extrakt, 10 g Pepton und für eine zusätzliche 20 g Agar Agarplatten.
   4. Fügen Sie 250 mL Leitungswasser und lösen Sie Komponenten auf.
   5. Autoklaven beide Medien separat bei 121 ° C für 20 min vorbereitet.
   6. Kombinieren Sie für Agarplatten 250 mL LB-Medium mit 750 mL künstliche Meer Wasser Medium direkt nach dem Autoklavieren und bereiten Sie Platten vor.
   7. Kombinieren Sie für flüssige Medium 250 mL LB-Medium mit 750 mL künstliche Meer Wasser Medium direkt nach dem Autoklavieren oder wenn abgekühlt.
      Hinweis: Das künstliche Meer Wasser Medium kann trübe durch Salz Niederschlag erhalten.
2. Streifen die Biolumineszenz Bakterienstämme auf künstliche Meer Wasser mittlerer Agarplatten und Inkubation über Nacht bei 24-30 ° C.
   Hinweis: Lange Lagerung von Bakterienstämmen wird normalerweise durch Einfrieren Glycerin Bestände der bakteriellen Kultur erreicht. Stämme sollten immer auf Agarplatten zuerst auf einheitliche Ausgangsbedingungen für alle Stämme, vor dem Gebrauch für flüssige Kulturen aufgrund einer Verzögerung Phase im Wachstum nach dem Auftauen versichern gestreift.
3. Bereiten Sie eine ONC durch impfen 100 mL künstliche Meer Wasser Medium mit einer einzigen Kolonie von der Platte. Inkubieren Sie ONC bei 24-30 ° C und 120 u/min in einem Inkubator-Shaker über Nacht.
4. 800 mL künstliche Meer Wasser Medium mit 8 mL ONC zu impfen.
5. Inkubieren Sie die Bakterienzellen bei 24-30 ° C und 120 u/min in einem Inkubator-Shaker.
   Hinweis: Die Lichtintensität Profil von biolumineszenten Bakterien variiert stark mit der Temperatur. Abhängig von der Regulationsmechanismen der leichten Produktion von den jeweiligen Bakterienstamm kann Lichtemission nach ca. 1-6 h gestartet.
6. Bakterienzelle Kultur zu beobachten, bis sie anfangen zu leuchten (ca. 1-6 h).
   Hinweis: Je nach Zweck des Ausdrucks, die Zellen werden bis zum nächsten Tag angebaut und dann geerntet werden, oder die Zellen können gehalten, schütteln, solange sie Leuchten. Ernte der Zellen und Reinigung Proteine kann nach Standardverfahren erfolgen.

4. in Vivo Aktivität Assay für die Biolumineszenz Bakterienstämme und veränderten E. Coli -Stämme

Hinweis: Lange Lagerung der Stämme ist normalerweise Acieved durch Einfrieren Glycerin Bestände an die Bakterienkultur. Stämme sollten immer auf Agarplatten zuerst auf einheitliche Ausgangsbedingungen für alle Stämme, vor dem Gebrauch für flüssige Kulturen aufgrund einer Verzögerung Phase im Wachstum nach dem Auftauen versichern gestreift.

1. Streifen der gewünschten Biolumineszenz Bakterienstamm oder veränderte E. Coli auf einer nährbodenplatte belasten und über Nacht bei 28 ° C inkubieren.
   Hinweis: Die Inkubationstemperatur kann variieren von Stamm zu Stamm und muss empirisch geprüft werden. Biolumineszenz Bakterienstämme zu vergleichen und veränderten müssen E. Coli -Stämme, Wachstumsbedingungen identisch sein.
2. 3 mL des Mediums mit dem jeweiligen Stamm mit einer einzigen Kolonie von einer nährbodenplatte zu impfen und die Zellen bei 28 ° C und 180 u/min in einem Inkubator Shaker für ca. 1-2 h inkubieren.
3. Messen Sie die Zelldichte von einem 01:10 Verdünnung der Flüssigkultur bei 650 nm. Berechnen Sie das Verhältnis und Volumen für 1 mL Kultur mit einem OD-₆₅₀ von 0,05.
   Hinweis: Die nachfolgenden Platte Leser Assay bestimmt die Zelldichte bei 650 nm zur Vermeidung von Interferenzen durch die Lichtabstrahlung der Stämme.
4. Pipette das berechnete Volumen der Kultur und Medium in einer 24-Well-Platte schwarz Einwandig mit Glasboden. Für die veränderten E. Coli Stamm, die Proben 1 µL Kanamycin (Antibiotika-Resistenz der pET28a Vektor) und 1 µL IPTG (Induktion der Genexpression) hinzugefügt werden. Deckel auf die Platte, um die Verdunstung während der Messungen zu vermeiden.
   Hinweis: Um sicherzustellen, dass der pET28a-Vektor, enthält das gesamte Lux Operon durch die E. Coli -Kultur nicht verloren geht, muss Kanamycin Samples E. Coli in den Vertiefungen der Platte und zu versichern, dass Licht die Produktion des E. Coli hinzugefügt werden Zellen können gemessen werden, muss der Genexpression mit IPTG induziert werden. Um Übersprechen und Messung Störungen zu vermeiden, schwarz-von Mauern umgebene well-Platten mit Glasboden und transparenten Deckel zeigten die besten Ergebnisse. Dennoch, Übersprechen beobachtet werden und auch Positionen müssen sorgfältig ausgewählt werden.
5. Starten Sie die Messung in einem Teller-Reader.
   Hinweis: Die Platte Leser Protokoll basiert auf einem Skript, speziell entwickelt für diese Probe (siehe Zusatzmaterial), zwei Messungen, Absorption und Biolumineszenz verbindet. Datenpunkte gesammelt werden alle 10 Minuten mit ständigen schütteln zwischen den Messungen und eine Konstante Temperatur von 28 ° C.

Die Gen-Reihenfolge der Lux Operon - LuxCDABFEG - ist über verschiedene Stämme^2,5,14hoch konserviert. Für die Gestaltung des Plasmids die sequenzinformation entstammt der Biolumineszenz Bakterienstamm Photobacterium Mandapamensis 27561 und seine gen-Reihenfolge blieb die gleiche, und Nichtkodierende Sequenzen zwischen einzelnen Genen wurden berücksichtigt. Ein schematischer Überblick über die angewandten Gibson Klonen Strategie ist in Abbildung 2dargestellt. Vier Fragmente insgesamt, LuxCDAB, LuxF, LuxEG, und RibEBH, mit 20-40 Basenpaare überlappende Sequenzen generiert wurden. Nach allen Schritten der Gibson Montage²⁰, bestätigt DNA-Sequenzierung die korrekte Montage des Plasmids, einschließlich alle Fragmente. Die Vektorkarte von der Endmontage Produkt pET28a mit der Lux-Rib -Operon ist in Abbildung 3dargestellt. Ein wesentlicher Vorteil dieser modifizierten pET28a-Vektor ist die Nutzung von standardisierten E. Coli Wachstumsbedingungen und Induktion mit IPTG kontrolliert.

Zur Messung der Lichtemission von biolumineszenten Bakterien und die jeweiligen Zelldichte wurde eine Platte Leser basierte Methode entwickelt. Die Methode für die Platte Leser wurde generiert Einzelmessung Skripte für Intensität und Zelle Leuchtdichte kombiniert. Dieses neue Skript ermöglicht die Messung von OD₆₅₀ und Lichtintensität alle 10 Minuten für einen Benutzer definierten Zeitrahmen, die hat die Generationszeit der Bakterien verwendet für die jeweilige Analyse (z. B. 10 h) angepasst werden. Die Messung der optischen Dichte erfolgte bei 650 nm zur Vermeidung von Interferenzen mit der Lichtemission. Als Beweis des Konzeptes und um die Gesundheit und die richtige wuchsverhalten der E. Coli Zellen zu gewährleisten wurden Referenzmessungen durchgeführt. In Abbildung 4 den Vergleich von E. Coli BL21 Zellen, E. Coli BL21 Zellen mit einem leeren pET28a-Vektor und E. Coli BL21 Zellen, in denen die pET28a-Vektor mit der Lux-Rib -Operon einfügen werden vorgestellt. Für die letztere Sorte wurde keine IPTG hinzugefügt, um die Lichtemission durch die Undichtigkeit des T7-Promotors zu analysieren. Alle drei Referenzmessungen zeigen eine sigmoidale Wachstumskurve mit drei Wachstumsphasen (Verzögerung, exponentielle und stationäre Phase). Nur die E. Coli BL21 Zellen der pET28a-Vektor mit dem Lux-Rippe Operon Insert Start Licht emittieren, aber im Gegensatz zu den Messungen mit dem Ausdruck durch Zugabe von IPTG und Licht induziert wird nach 30 min, die nicht induzierten Zellen emittiert erst nach ca. 5 h glänzen und zeigen eine viel niedrigere Lichtemission (ca. 4-fold) gegenüber dem induzierten System.

Abbildung 5 gibt einen Vergleich der Wachstumskurven und Lichtintensitäten von der Lux -Operon in E. Coli und der Biolumineszenz Bakterienstamm p. Mandapamensis 27561, entweder in LB-Medium oder in künstlichen See Wasser Medium zum Ausdruck gebracht, mit dem Roman hergestellt in Situ -Methode. Um diese Bakterien zu vergleichen, wurden die Messungen bei einer Inkubationstemperatur von 28 ° C. Diese Temperatur sinkt die Wachstumsrate des veränderten E. Coli Stamm in LB-Medium sowie künstliche Meer Wasser Medium, aber bei etwas niedrigeren Temperaturen Biolumineszenz Bakterienstämme sind von entscheidender Bedeutung. Dieser Temperatur-Abhängigkeit ist in Abbildung 5A, sichtbar, wie p. Mandapamensis 27561 eine viel höhere Zelldichte als E. Coli zeigt. Außerdem, während für E. Coli -Stämme, LB-Medium ermöglicht die Erzeugung von höhere Zelldichten für natürliche Biolumineszenz Bakterienstämme, künstlichen See Wasser Medium ist bevorzugte und wichtig für die Biolumineszenz. Die aufgezeichneten Zelldichten korrelieren mit der jeweiligen Lichtintensitäten, wie in Abbildung 5Bgezeigt. Bemerkenswert, die Biolumineszenz E. Coli Zellen erreichen ähnliche Licht Emission Maxima in beiden LB mittlere sowie künstliche Meer Wasser Medium, obwohl die höchsten Intensitäten zu unterschiedlichen Zeitpunkten aufgezeichnet wurden. Im Gegensatz zu dieser Beobachtung, p. Mandapamensis 27561 ist mit stark reduzierten Wachstumsraten in LB-Medium, aber die Bakterienzellen nicht emittieren Licht an alle (Abb. 5B). In künstlichen See Wasser Medium zeigt p. Mandapamensis 27561 maximal Lichtemission von ca. 1 x 10⁴ zählt pro Sekunde, was fast ein Faktor von 200 niedriger als E. Coliist. Abbildung 5 C steht für relative leichte Einheiten, wo die Biolumineszenz durch die OD normalisiert ist. Diese Ergebnisse bestätigen, dass nicht nur die Einfügung von einem Plasmid Lux Operon in E. Coli erfolgreich und funktional enthält war, sondern auch, dass dies E. Coli geändert Stamm bildet eine interessante Alternative mit noch höheren Lichtaustritt Erträge und ohne Begrenzung der bakteriellen Biolumineszenz von Marina Bakterien, wie z. B. eine komplexe Meerwasser mittleren und niedrigeren Temperaturen.

Darüber hinaus wurde eine Langzeitmessung der E. Coli basierte Lux-Rippe Genexpression über 24 h durchgeführt, um die Langlebigkeit der Lichtemission (Abbildung 6) zu analysieren. Lichtemission für 19,5 h gedauert, viel länger als die Bakterienstämme (z. B. p. Mandapamensis 27561), wo eine allmähliche Abnahme wurde beobachtet, was zu sehr geringen Lichtabstrahlung nach 10 h.

Um die Einschränkungen des entwickelten Tests zu verdeutlichen, zeigt Abbildung 7 die Messergebnisse von drei Biolumineszenz Bakterienstämmen, nämlich Photobacterium Mandapamensis S1, Photobacterium Mandapamensis TH1 und Vibrio Harveyi 14126. Für die erste Sorte (S1) die Methode funktioniert sehr gut und zeigt eine maximale Biolumineszenz Intensität von fast 2 x 10⁶. Für die anderen zwei Stämme (TH1 und 14126), die maximale Lichtstärke kann nicht bestimmt werden, da die Lichtintensität durch beide erzeugt die Nachweisgrenze des verwendeten Geräteeinstellungen überschritten. Der Gain-Wert definiert für die entwickelte Methode (Skript) für diese beiden Stämme war zu hoch eingestellt. Dennoch kann das Auftreten von Biolumineszenz Aktivität miteinander verglichen werden. P. Mandapamensis TH1 und p. Mandapamensis S1 starten scheint nach ca. 1 h und einem OD-₆₅₀ -Wert von 0,1 - 0,2, beziehungsweise. Im Gegensatz dazu beginnt V. Harveyi 14126 emittieren Licht nach ca. 5,5 h bei einem OD-₆₅₀ -Wert von 1,0. Die beobachteten Ausbruch der Lichtemission wird von einer exponentiellen Zunahme OD sowie Biolumineszenz begleitet. Es ist bekannt, dass Biolumineszenz von V. Harveyi 14126 Quorum-sensing-Regelung zu Grunde liegt und daher eine bestimmte Zelle Dichte ermöglicht die Aktivierung von Lux Operon, die in Abbildung 7¹³deutlich zu beobachten ist. Dieses Ergebnis zeigt, dass mit dieser neuartigen in Situ Platte-Leser-Test ist es möglich, schnell und einfach vergleichen biolumineszente Bakterien und auch grob definieren ein Regulationsmechanismus dieser Stämme durch die Bestimmung, ob ein Quorum-sensing-Regelung kann beobachtet oder nicht.

Abbildung 8 zeigt ein Beispiel für einen Ausdruck Kultur von E. Coli BL21 Zellen beherbergen die montierten pET28a Plasmid enthält die Lux Operon nach Induktion mit IPTG. Nach ca. 1 h nach Induktion beginnen die E. Coli -Zellen scheint mit einer blau-grünen Farbe. Abbildung 8 A zeigt dem E. Coli -Ausdruck Kultur in das Licht fotografiert und Abbildung 8B gibt die gleiche Kultur im Dunkeln. Abbildung 8 C zeigt eine Agarplatte der künstliche See Wasser Medium mit p. Mandapamensis S1 Glühen in der Dunkelheit in dem gleichen blau-grüne Farbe charakteristisch für bakteriellen Biolumineszenz.

Abbildung 2 : Schematische Darstellung der angewandten Gibson Klonen Strategie. Schritt (I): Überlappungen Primer (farbige Pfeile; ca. 20-40 Basenpaare überlappen) dienen. Überlappende Primer enthalten annealing Sequenzen bestehend aus der jeweiligen Region 5' und 3' ein Fragment und die jeweiligen 3' und 5' Region von dem angrenzenden Segment. Schritt (II): Die gestaltete Fragmente für die Montage werden über standard-PCR-Reaktionen erzeugt. Schritt (III): Der Ziel-Vektor wird durch Beschränkungsverdauung (z. B. NcoI, XhoI) linearisiert. Schritt (IV): Die DNA-Konzentrationen von alle Fragmente und der linearisierten Vektor müssen entschlossen, Konzentration für Gibson Montage (laut Protokoll des Herstellers) einzustellen. Schritt (V): Alle Fragmente und der linearisierten Vektor mit optimierten DNA-Konzentrationen mit der Gibson Montage master-Mix (T5 Exonuclease, DNA-Polymerase und DNA-Ligase) kombiniert werden und sind bei 50 ° C für 1 h inkubiert Schritt (VI): der Versammlung Produkt verwandelt Laut standard-Protokolle in eine geeignete E. Coli Stamm für die high-Yield-Plasmid-Replikation (z. B. E. Coli TOP10 oder XL-1). Schritt (VII): Überprüfen Sie die korrekte Montage des Plasmids, muss DNA-Sequenzierung des montierten Plasmids durchgeführt werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3 : Vektorkarte von pET28a mit der Lux-Rippe Operon. Die Lux-Rib -Operon von p. Mandapamensis 27561 wird in die Site mit mehreren Klonen von pET28a in der ursprünglichen Reihenfolge gen (LuxCDABFEG-RibEBH) eingefügt. Restriktionsschnittstellen verwendet für das Klonen sind NcoI und XhoI. Fragmente für Gibson Versamlung der Operon verwendet werden LuxCDAB in Orange, LuxF grün, LuxEG in blau und RibEBH in Lavendel; Gene innerhalb eines Fragments werden als separates Feld angezeigt. Nichtkodierende Sequenzen zwischen jedes Gen die Operon gehören die angewandte Klonen Strategie. Die endgültige Plasmid Größe pET28a, enthält das gesamte Lux-Rib -Operon ist 14.625 Basenpaare. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4 : Vergleich von Wachstumskurven und Lichtintensitäten Referenzstämme. Die OD bei 650 nm und die Biolumineszenz Intensität in zählt pro Sekunde gemessen wurden alle 10 min über 10 h bei 28 ° C. Alle Maße sind Mittelwerte von drei biologische Wiederholungen mit vier technischen repliziert. Fehlerbalken darzustellen Standardabweichungen. E. Coli BL21 Zellen (graue Quadrate), E. Coli BL21 Zellen mit einem leeren pET28a Vektor (graue Kreise) und E. Coli BL21 Zellen mit der pET28a-Vektor mit dem Lux-Rippe Operon Einsatz (Black Diamond) wurden analysiert, um korrektes Wachstum Verhalten unserer E. Coli -Zellen zu gewährleisten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. 

Abbildung 5 : Vergleich der Wachstumskurven und Lichtintensitäten von Lux Operon ausgedrückt 27561 (Kreise) in LB-Medium (offene Symbole) oder künstliche Meer Wasser Medium (gefüllte Symbole) in E. Coli (Quadrate) und p. Mandapamensis . Alle Maße sind Mittelwerte von drei biologische Wiederholungen mit vier technischen repliziert. Fehlerbalken darzustellen Standardabweichungen. Alle Experimente wurden bei einer Inkubationstemperatur von 28 ° c durchgeführt. (A) optische Dichte (OD) Messungen bei 650 nm durchgeführt wurden alle 10 Minuten für 10 h. E. Coli Lux Operon Ausdruck (linken), p. Mandapamensis 27561 (Rechte Abbildung) in LB-Medium und künstlichen See Wasser Medium verglichen wird. Zelldichten richten sich bei 650 nm um Biolumineszenz-Störungen zu vermeiden. (B) Messung der Lichtintensität (Biolumineszenz [Grafen/s]) erfolgte alle 10 Minuten für 10 h. E. Coli Lux Operon Ausdruck (linken) p. Mandapamensis 27561 (Rechte Abbildung) in LB im Vergleich zu Mittel- und künstlichen See Wasser Medium. (C) Relative Licht-Intensität (RLU/OD) von der Lux -Operon in E. Coli (links) und p. Mandapamensis 27561 (Rechte Abbildung) ausgedrückt werden durch die Normalisierung der Biolumineszenz, Zelldichte bestimmt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 6 : Vergleich der Wachstumskurven und Lichtintensitäten von E. Coli basierte Lux Genexpression für 24 h Die OD bei 650 nm und die Biolumineszenz Intensität in zählt pro Sekunde gemessen wurden alle 10 min über 24 h bei 28 ° C. Alle Maße sind Mittelwerte von drei biologische Wiederholungen mit vier technischen repliziert. Fehlerbalken darzustellen Standardabweichungen. Darüber hinaus sind die relative Lichtintensitäten (RLU/OD) wo Biolumineszenz von Zelldichte normalisiert ist vertreten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 7 : Vergleich von biolumineszenten Bakterien, potenzielle Quorum-sensing-Regelung zu bewerten. Lichtaustritt und Zelldichte werden alle 10 Minuten für 10 h gemessen und stellen Mittelwerte von drei biologische Wiederholungen mit vier technischen repliziert. Fehlerbalken darzustellen Standardabweichungen. Messungen der Photobacterium Mandapamensis TH1 (schwarze Quadrate), Vibrio Harveyi 14126 (graue Kreise) und Photobacterium Mandapamensis S1 (graue Diamanten) waren im Vergleich zu anderen; (A) zeigt die optische Dichte (OD) bei 650 nm, (B) das Licht Intensität (Biolumineszenz [Grafen/s]) und (C) relative Lichtintensitäten (RLU/OD). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 8 : Biolumineszenz in flüssigen Medien und auf Agarplatten. (A) 5 L Flasche mit 2 L LB-Medium mit E. Coli BL21 Zellen mit dem Ausdruck der pET28a Lux Operon Plasmid in Licht fotografiert geimpft. (B) die gleiche Kultur wie in (A) im Dunkeln fotografiert. Bilder A und B wurden ca. 2 h nach Induktion der Expression. (C) künstliche Meer Wasser mittlerer Agarplatte mit gestreift Kultur von p. Mandapamensis S1 im Dunkeln fotografiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Der Bau einer expressionsplasmid mit vier Fragmente komponieren das gesamte Lux-Rippe -Operon von p. Mandapamensis 27561 wurde über Gibson Klonen erreicht. Dieses E. Coli basierte Lux Genexpression kann E. Coli Zellen Licht emittieren. Quorum-sensing-Regelung und nicht standardmäßige Wachstumsbedingungen zu vermeiden, sind wesentliche Vorteile dieses Systems.

Die Vorteile der Verwendung von Gibson Klonen Strategie sind die einfache Montage von mehreren linearen DNA-Fragmente, hohe Flexibilität und keine Notwendigkeit einer besonderen Beschränkung Seiten^18,19,20. Diese Methode ermöglicht auf einfache Weise eine Lux Operon, mit Ausnahme einzelner Gene oder Gen-Cluster oder Einführung neuer Gene oder den Austausch von Genen aus einem Stamm mit einer anderen ändern. Voraussetzung für die Anwendung dieser Methode ist die Verfügbarkeit der jeweiligen Lux Operon Gensequenz. Nur für eine kleine Anzahl von biolumineszenten Bakterien ist die vollständige DNA-Sequenz des jeweiligen Lux Operon bekannt bzw. erhältlich. Viele dieser Sequenzen sind fragmentiert, weil sie mit Schrotflinte Sequenzierung generiert wurden. Bei den untersuchten p. Mandapamensis 27561 die vollständige DNA-Sequenz des Lux Operon ist bekannt und von der NCBI-Gen-Datenbank zur Verfügung (GenBank: DQ988878.2).

Ein entscheidender Schritt in das Protokoll der Versammlung Gibson ist die Berechnung der DNA-Konzentration der einzelnen Fragmente. In der Versammlung Protokoll des Herstellers es empfohlen wurde, 0,2 - 0,5 Pmols und einem Gesamtvolumen von 20 µL für 4-6 Fragmente^20,21. In unserem Fall, wo der LuxCDABFEG-RibEBH aus 4 Fragmente besteht, waren die Konzentrationen und Gesamtmengen 0.1 Pmol und 45 µL bzw., je nach den Ertrag der PCR-Produkte. Auf der einen Seite die Konzentration reduziert werden musste und auf der anderen Seite musste die Lautstärke erhöht werden. Dennoch die Montage funktionierte sehr gut und DNA-Sequenzierung bestätigt das korrekte einfügen auf Anhieb. Diese Feststellung bestätigt Gibson Assembly als eine robuste und geeignete Methode für unsere Untersuchungen, die leicht modifizierte^18,19,20.

Die neu gegründete Teller-Leser-Assay ist ein einfach zu bedienendes Methode. Es ermöglicht eine einfache primäre Analyse der neu oder (UN-) bekannte Biolumineszenz Bakterienstämme und gibt bereits einen ersten Hinweis auf den regulatorischen Mechanismus der light-Production (z. B. verzögerten Lumineszenz bei niedrigen Zelldichten). Darüber hinaus können Wachstumsbedingungen in Kombination mit leichten Produktion leicht ausgewertet werden, indem einfach Wachstumsmedium oder Temperatur.

Die Messungen mit dem Teller-Leser wurden bei 28 ° C. Der Grund für diese ungewöhnliche Einstellung ist die Temperaturempfindlichkeit der Biolumineszenz Bakterienstämme, wo Temperaturen über 30 ° C zu weniger oder gar keine Wachstum und/oder Lichtemission führen. Beachten Sie, dass die Platte Leser eine definierte Temperatur im Laufe der Zeit mit der Einschränkung von einer fehlenden aktiven Kühlsystem zu halten vermag. Daher muss die Umgebungstemperatur unter die Temperatur der Messung.

Als ein Proof of Concept der Vergleich von E. Coli -Konstrukt mit der Biolumineszenz Belastung p. Mandapamensis (Abbildung 5) auf der einen Seite und die Referenzmessungen (Abbildung 4) auf der anderen Seite wurden durchgeführt und bestätigen die Zuverlässigkeit dieses neu geschaffenen Systems. Darüber hinaus versichert der Langzeitmessung die Langlebigkeit der Lichtemission (Abbildung 6). Aber man muss berücksichtigen, dass OD-Werte nicht zuverlässig über eine bestimmte optische Dichte, abhängig von den Eigenschaften des verwendeten Messgerät (ca. 15 h im vorliegenden Fall) wo eine entsprechende Verdünnung für eine Messung in bräuchte der linearen Bereich des Detektors. Diese hohe Abweichungen im OD-Werte machen diese lange Messungen nicht zuverlässig. Daher sind kürzere Messungen wie 10 h empfohlen, mit dem experimentellen Setup hier berichtet.

Grenzen der etablierten Platte Leser Assay ist in Abbildung 7ersichtlich. Die Schwierigkeit besteht darin, eine geeignete Einstellung der Messung zu finden. Die "Wertschöpfung" regelt die Empfindlichkeit der Foto-Multiplikator-Röhre (PMT). Der Gewinn ist die Verstärkung des Signals in der PMT, was bedeutet, dass das Signal zu ein höheren Gain-Faktor erhöhen wird. Wenn der Gewinn zu niedrig gesetzt ist, wird das Signal-Rausch-Verhältnis größer und Lichtintensitäten von "niedrig" leuchtendes biolumineszenten Bakterien lässt sich nicht mehr (Signale nahe Null, Daten nicht gezeigt) gemessen. Die Herausforderung in einem Biolumineszenz Assay soll die Verstärkung eingestellt, so dass die Messergebnisse für alle Bakterienstämme innerhalb des Bereichs des Instruments bleiben. Darüber hinaus hängt der Messbereich für Lumineszenz Intervall Messzeit (z. B. bis zu 2.000.000 für 1 s).

Der Gewinn wurde auf 2800, festgelegt, die empirisch geprüft und ausgewählt für den spezifischen Platte-Leser für die Einrichtung dieser Methode verwendet wurde. Die verwendeten Gain-Einstellung ermöglicht die Aufnahme von maximal abgestrahlten Lichts durch die Biolumineszenz E. Coli System, p. Mandapamensis 27561 und p. Mandapamensis S1 ohne Überlauf, aber für die Stämme p. Mandapamensis TH1 und V. Harveyi 14126 der Gewinn war zu hoch. Daher diese letzteren Stämme überschreiten die Nachweisgrenze und die reale maximale Lichtintensität nicht gemessen werden kann. Diese technische Einschränkung könnte den Vergleich von biolumineszenten Bakterien vermeiden, die hohe Temperaturschwankungen in der maximale Lichtemission zu zeigen, obwohl Wachstumsbedingungen und Zelldichten vergleichbar sein könnte.

Positionierung der analysierten Bakterienstämme innerhalb der verwendeten well-Platten muss empirisch geprüft werden. Obwohl schwarz-well-Platten mit Glas Böden verwendet wurden, wurde Übersprechen zwischen den Proben beobachtet. Die Lichtintensität des spezifischen Belastungen ist so hoch, dass alle benachbarten Brunnen falsche positive Lichtemissionen (z. B. leer) angezeigt werden. Daher ist es wichtig, zwei verschiedene Stämme entweder separat oder mit einer bestimmten räumlichen Trennung miteinander zu messen.

Es gibt bereits viele geändert E. Coli -Stämme bekannt, die Teile der Lux Operon enthalten und sind vor allem anwendungsorientierte^15,16,17. Die hier beschriebenen Methoden darauf abzielen, Grundlagenforschung, zum Beispiel die Möglichkeit der Analyse jedes Lux gen getrennt. Obwohl Forschung der Biolumineszenz eine lange Geschichte hat, gibt es noch viele offene Fragen. Durch Ausschluss eingeschleuste Gene von Lux Operon, den Austausch der LuxAB Gene mit Genen aus einem anderen Stamm oder Analyse von Protein-komplexe, eingebettet in die einfache Handhabung von E. Coli System- und weiter der Platte Leser-Assay, kann es sein, weitere Informationen über regulatorische Prozesse und Funktionen des Lux -Gene zu gewinnen.

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Wir wollen danken Wladislaw Maier (BMG Labtech GmbH) für seine Unterstützung beim Aufbau der selbst geschriebenen Skripts für den Teller-Leser. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die österreichische "Fonds Zur Förderung der Wissenschaftlichen Forschung" (FWF), PM (P24189) und das PhD-Programm "DK Molekulare Enzymologie" (W901) bis Uhr.