في الموقع القياس والعلاقة بين كثافة الخلية وانبعاث الضوء من البكتيريا طرحه

البكتيريا طرحه تنظيم إنتاج الضوء من خلال مجموعة متنوعة من الآليات مثل الاستشعار من النصاب القانوني. يسمح هذا الأسلوب رواية التحقيق في عين المكان للإضاءة الحيوية والترابط بين الانبعاثات الخفيفة لكثافة الخلية. طرحه اصطناعية الإشريكيّة القولونية يسمح نظام توصيف تجتمع لوكس والبروتينات لوكس وتفاعلها.

هناك عدد كبير من أنواع البكتيريا قادرة على التي ينبعث منها الضوء. كل منهم حصة الكتلة الجينات نفسها، إلا وهي مشغل لوكس . وعلى الرغم من هذا التشابه، إظهار هذه البكتيريا التغيرات المتطرفة في الخصائص مثل السلوك النمو، وكثافة الانبعاثات الخفيفة أو تنظيم الإضاءة الحيوية. الطريقة المعروضة هنا هي مقايسة وضعت حديثا يجمع بين تسجيل نمو الخلايا وكثافة الانبعاثات الخفيفة طرحه على مر الزمن استخدام قارئ لوحة. ويمكن ربط نمو الناتج وخصائص الانبعاثات الخفيفة إلى الميزات الهامة للسلالة البكتيرية كل منها، مثل النصاب الاستشعار عن التنظيم. زراعة مجموعة من البكتيريا طرحه يتطلب وسيلة محددة (مثل البحر الاصطناعي المياه المتوسطة) وتحديد درجات الحرارة. سهلة للتعامل معها، غير طرحه معيار البحث بكتيريا الإشريكيّة القولونية (كولاي)، من ناحية أخرى، يمكن أن تزرع غير مكلفة بكميات عالية في نطاق المختبر. استغلال كولاي عن طريق إدخال بلازميد التي تحتوي على كامل لوكس مشغل يمكن تبسيط الشروط التجريبية و بالإضافة إلى ذلك يفتح إمكانيات عديدة للتطبيقات المستقبلية. جميع الجينات لوكس الاستفادة سلالة تعبير كولاي أنجز بناء بلازميد التعبير عن طريق الاستنساخ جيبسون والإدراج من أربعة أجزاء تحتوي على سبعة لوكس الجينات والجينات الأضلاع الثلاثة من مشغل لوكس-الضلع إلى ناقل pET28a. يمكن المستحث كولاي أساس لوكس التعبير الجيني والتحكم عن طريق إضافة الأيزوبروبيل-β-د-ثيوجالاكتوبيرانوسيد (إيبتج) أسفر عن طرحه كولاي الخلايا. مزايا هذا النظام تجنب النصاب الاستشعار عن قيود التنظيم والتراكيب متوسطة المعقدة جنبا إلى جنب مع ظروف النمو غير قياسي، مثل تحديد درجات الحرارة. هذا النظام يتيح تحليل الجينات لوكس وتفاعلها، باستبعاد الجينات الخاصة بكل منها من مشغل لوكس ، أو حتى إضافة الجينات الجديدة، تبادل الجينات لوكساب من سلالة بكتيرية واحد آخر، أو تحليل البروتين المجمعات، مثل لوكسكدي.

انبعاث الضوء بالكائنات الحية (الإضاءة الحيوية) عملية رائعة موجودة في البكتيريا والفطريات والحشرات، والديدان الخيطية، والأسماك والحبار¹. انبعاث الضوء طرحه ينبثق من فعل تشيميلومينيسسينت التي تتحول الطاقة الكيميائية (جزئيا) إلى الطاقة الضوئية (الباردة الضوء ""). في البكتيريا طرحه، ويحفز لوسيفراس الإنزيم هيتيروديميريك مونوكسيجينيشن سلسلة طويلة، الألدهيدات الاليفاتيه، مثل تيتراديكانال، للأحماض المقابلة التي يصحبها انبعاث الضوء مع كحد أقصى في 490 نيوتن متر^{2، 3}.

الشكل 1 : نظام رد الفعل العام للبكتيريا لوسيفراس. لوسيفراس البكتيرية (لوكساب) يحفز مونوكسيجينيشن سلسلة طويلة خفضت الألدهيدات (₃(الفصل₂) CH_نشو) باستخدام مونونوكليوتيدي فلافين (فمنه₂) والأوكسجين الجزيئي (س₂)، مما أسفر عن المنتجات منذ وقت طويل سلسلة الأحماض (الفصل₃(الفصل₂)_nCOOH)، فلافين مونونوكليوتيدي (فمن) والمياه (ح₂س) وانبعاث الضوء تركزت في 490 نانومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الطاقة المنطلقة أثناء أكسدة هذا يسبب حالة متحمس FMN-4a-هيدروكسيد، هو بمثابة الضوء التي تنبعث منها لوسيفرين⁴. يتم ترميز بواسطة مشغل لوكس البروتينات المشاركة في الإضاءة الحيوية البكتيرية، إلا وهي لوكسكدابيج، وهي شديدة المحافظة على السلالات البكتيرية المختلفة^2،5. ترميز الجينات luxA و لوكسب لوسيفراس هيتيروديميريك؛ منتجات الجينات في لوكسكو في لوكسد لوكس عنصرين من عناصر ريدكتيز الأحماض الدهنية المعقدة؛ و لوكسج بترميز ل ريدكتيز فلافين⁶. عدد من طرحه فوتوباكتيريا (ماندابامينسيس e.g.,Photobacterium 27561) تحمل الجينات الإضافية مبلغ . وأفيد أن مبلغ هو بروتين هوموديميريك الذي يربط فلافين غير عادية مشتق 6-(3'-(R)-ميريستيل)-فمن (ميرفمن)^7،،من^{89،10،11 ،12}. إضافية تم التعرف على الجينات المسؤولة عن توليف فيتامين بي (مثلاً، ريبيبه) وعلاوة على ذلك تنظيم الجينات وأبلغ، التي تلعب دوراً في تنظيم الاستشعار عن النصاب القانوني للإضاءة الحيوية، لا سيما بالنسبة الضمة fischeri ، و هارفي الضمة^6،13. ترتيب الجينات المصانة عاليا، وعلى الرغم من إظهار البكتيريا طرحه اختلافات كبيرة في خصائص مثل السلوك النمو، كثافة الانبعاثات الخفيفة، أو تنظيم الإضاءة الحيوية^2،5،14 .

تعديل عدة سلالات أو البلازميدات المحتوية على أجزاء أو تجتمع كلها لوكس معروفة واستغلال الإضاءة الحيوية كنظم مراسل. تطبيقات مختلفة مثل تحديد نشاط المروج، ورصد التلوث البكتيري في البيئة أو عينات المواد الغذائية، الإضاءة الحيوية الرنين الطاقة نقل (بريت)، في فيفو تصوير الإصابات في الكائنات الحية حقيقية النواة، وكانت بيروسيكوينسينج، وهكذا دواليك المنشأة^15،،من¹⁶¹⁷. Interestingly, the three most frequently used bioluminescent reporter systems are derived from the North American firefly (Photinus pyralis), the enteric pathogen of nematodes (Photorhabdus luminescens), and the sea pansy (Renilla رينيفورميس). أيا من تلك النظم منشأ بكتيرية، ولكن استخدام الجينات لوكس وتجتمع من أصول البكتيرية تكتسب المزيد من الاهتمام للبحوث التطبيقية¹⁶. تطبيق أقل وفيرة من البروتينات الإضاءة الحيوية من مصادر البكتيرية يرجع أساسا إلى انخفاض الاستقرار وطول عمر بكتيريا تستمد الإنارة البروتينات التي يمكن أن تتصل بهم الموائل البحرية. لا تكون البكتيريا طرحه للموائل البحرية الصالحة للزراعة تحت ظروف المختبر القياسية. وتتطلب هذه البكتيريا وسائط النمو المحددة والشروط، مثل البحار الاصطناعية متوسطة ومنخفضة النمو/حضانة درجة حرارة المياه (مثلاً، 28 درجة مئوية).

لتبسيط مقارنة خصائص مشغل لوكس أو واحد لوكس جينات مجموعة من السلالات البكتيرية طرحه مختلفة، طريقة لتوحيد لوكس مشغل التعبير والتحليل شرطا. وهكذا، برزت فكرة دمج مشغل كامل لوكس-ضلع في معيار البحث بكتيريا الإشريكيّة القولونية (كولاي). لهذا الغرض، أثبتت الجمعية جيبسون أداة مفيدة لدمج متعددة الأجزاء الخطية، متداخلة في ناقلات تعبير واحد دون الحاجة لمواقع قيود محددة. هذا الأسلوب أيضا مناسبة عند إدراج الحمض النووي كبيرة جداً (e.g.,P. ماندابامينسيس 27561 لوكسكدابفيج-ريبيبه؛ ~ 9 كيلو بايت حجم مشغل) تضخيم عبر PCR. مشغل لوكس يمكن فصلها إلى أجزاء متعددة متداخلة، ثم يتم تجميعها في تعبير واحد بلازميد وأخيراً التسلسل التحقق من المنتج الجمعية يمكن أن تتحول مباشرة إلى مناسبة كولاي نظام عالية الغلة بروتين التعبير^18،،من¹⁹²⁰. بالإضافة إلى سهلة للتعامل مع كولاي أساس لوكس التعبير الجيني، ظلت طريقة بسيطة للجمع بين تسجيل نمو الخلايا وطرحه الانبعاثات الخفيفة التي ستنشأ. يسمح الأسلوب الموصوفة هنا في الموقع القياس والعلاقة بين كثافة الخلية وانبعاث الضوء من البكتيريا طرحه.

تحليل الجينات لوكس لوكس مشغل النظام والتنظيم للبكتيريا طرحه المختلفة، من ناحية، طرحه اصطناعية كولاي النظام يحتوي على مشغل كامل لوكس-الضلع من ص ماندابامينسيس من ناحية 27561، ومن ناحية أخرى، مقايسة قارئ لوحة المطورة حديثا الجمع بين التسجيل في الموقع من كثافة الخلية وانبعاث الضوء، يساعد للحصول على مزيد من المعلومات عن مختلف النظم البكتيرية لوكس . قد يؤدي هذا التوصيف الأساسية والمقارنة بين لوسيفيراسيس والأنزيمات ذات الصلة إلى بدائل لنظم مراسل المنشأة بالفعل مع تعزيز الاستقرار والنشاط.

1-تصميم وإعداد، والتعبير عن لوكس مشغل في الإشريكيّة القولونية

ملاحظة: انظر الجدول للمواد للمعلومات المتعلقة بمجموعات تجارية تستخدم في هذا القسم.

1. لتحويل مشغل لوكس إلى كولاي اختيار ناقل الحيوانات الأليفة قياسية مع مواقع التقييد الملائمة والجينات المقاومة للمضادات الحيوية للفائدة (مثلاً، pET28a؛ نكوي، زهوي، كاناميسين).
2. تصميم الأجزاء وتداخل كبسولة تفجير للجمعية جيبسون استناداً إلى تسلسل الحمض النووي من ماندابامينسيس فوتوباكتيريوم 27561 (بنك الجينات: DQ988878.2).
3. قم بإعداد رد فعل PCR قياسية مع كبسولة تفجير تصميم والحمض النووي الجينومي معزولة من ماندابامينسيس فوتوباكتيريوم 27561 كقالب (انظر مواد تكميلية للإشعال والشروط).
   ملاحظة: عزل الحمض النووي للسلالة البكتيرية كل منهما يعزز فعالية PCR.
4. تنقية المنتج بكر عبر تنقية عمود الدوران.
5. أداء هضم تقييد ناقل pET28a معزولة مع نكوي وزهوي في 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.
6. تنقية الموجه خطية والشظايا بكر عبر [اغروس] هلام التفريد وتنقية عمود الدوران اللاحقة.
7. تحديد تركيز الحمض النووي لكل جزء وناقلات خطية وحساب الكميات المثلى للجمعية العامة وفقا لبروتوكول^20،21.
   ملاحظة: فعالية الجمعية العامة يتوقف على حجم الشظايا وعدد وقد يتم تعديلها وفقا للشركة المصنعة لبروتوكول^20،21.
8. بعد الجمع بين كافة الأجزاء والمخزن المؤقت في أنبوب بكر، احتضان الجمعية المخلوط في جهاز PCR عند 50 درجة مئوية لح 1.
9. تحويل المنتج ناقلات تجميعها وفقا لبروتوكولات التحويل القياسي لتحويل بلازميد البكتيريا كولاي إلى مناسبة كولاي نظام عالية الغلة بلازميد النسخ المتماثل (مثلاً، كولاي TOP10 أو XL-1).
10. اختيار المستعمرات من لوحة التحويل والانتصارات في لوحات جديدة لعزل الحمض النووي.
11. عزل الحمض النووي بلازميد وفقا للبروتوكولات القياسية.
12. للتحقق من التجميع الصحيح من بلازميد بما في ذلك كافة الأجزاء، إجراء أول مستعمرة [بكر] وفقا لبروتوكولات قياسية محددة كبسولة تفجير لكل جزء تجميعها باستخدام.
13. بالإضافة إلى ذلك إلى مستعمرة [بكر] واللاحقة [اغروس] هلام التفريد، إعداد جميع ناقلات الجمعية معزولة لتسلسل الحمض النووي للتحقق من التجميع الصحيح وتسلسل الحمض النووي الصحيح.
14. تحويل بلازميد تم التحقق منها وفقا لبروتوكولات التحويل القياسي لتحويل بلازميد البكتيريا كولاي إلى مناسبة كولاي نظام لإنتاج البروتين عالية الغلة (القولونية e.g.,E. BL21).
    ملاحظة: تواصل مباشرة مع بروتوكول التعبير أدناه. لتخزين أطول، من المستحسن إعداد مخزون والغليسيرول.

2-التعبير عن سلالات معدلة كولاي

1. إعداد ثقافة بين عشية وضحاها (قدو) للتعبير بالتطعيم الحجم المناسب من المتوسطة رطل (مثلاً 100 مل) مع الأسهم والغليسيرول معدّة مسبقاً من الخلايا BL21 كولاي تحولت مع بلازميد تجميعها أو مباشرة من لوحة التحويل. إضافة 100 ميليلتر من كاناميسين (50 ملغم/مل؛ الجينات المقاومة للمضادات الحيوية من pET28a) واحتضان قدو في 37 درجة مئوية و 120 دورة في الدقيقة في شاكر حاضنة بين عشية وضحاها.
2. تلقيح ثقافة التعبير الرئيسي (مثلاً 800 مل متوسطة رطلا) مع 8 مل من قدو وإضافة 800 ميليلتر من كاناميسين (50 ملغم/مل).
3. احتضان ثقافة الرئيسي في 37 درجة مئوية و 120 دورة في الدقيقة في شاكر حاضنة حتى تصل إلى كثافة الخلية القطر خارجي₆₀₀ من 0.6-0.8 (حوالي 2.5 ح).
4. خفض درجة حرارة الحضانة إلى 28 درجة مئوية.
5. حمل التعبير البروتين بإضافة إيبتج إلى تركيز نهائي من 0.1 ملم.
   ملاحظة: الاختبارات التجريبية أظهرت أن خفض درجة الحرارة إلى 28 درجة مئوية يعطي أعلى كثافة الضوء.
6. مراقبة الخلايا حتى يبدأون الساطع (حوالي 1 ح).
   ملاحظة: استناداً إلى غرض التعبير، الخلايا تزرع حتى اليوم التالي ويتم حصادها بعد ذلك، أو يمكن أن تكون الخلايا أبقى تهز طالما أنها هي الساطع (48 ساعة كحد أقصى). يمكن أن يتم جمع الخلايا وتنقية البروتينات أي وفقا للإجراءات المعيارية.

3-التعبير عن السلالات البكتيرية طرحه

ملاحظة: تتطلب السلالات البكتيرية طرحه المتوسطة مياه البحر المتوسط/الاصطناعية النمو المحددة للنمو والإنتاج الخفيفة.

1. تعد المتوسطة مياه البحر الاصطناعي، تتألف من عنصرين متوسطة معدّة بشكل منفصل.
   ملاحظة: تم تكييفها مع إعداد متوسطة مياه البحر الاصطناعي من البروتوكول الأصلي²². المبالغ التالية للمتوسطة 1 لتر سائل أو 1 لتر أجار المتوسطة.
   1. البحر الاصطناعي المياه المتوسطة، تزن في الأملاح التالية: 28.13 غ كلوريد الصوديوم، غ 0.77 بوكل، ز 1.60 كاكل₂ · 2 ح₂س، ز 4.80 مجكل₂ · 6 ح₂س وز 0.11 ناكو₃وز 3.50 مجسو₄ · 7 ح₂o.
   2. إضافة 1 لتر ماء المقطر وحل كافة المكونات.
   3. ليبره المتوسطة، تزن في المكونات التالية: استخراج الخميرة ز 10، 10 جرام ببتون، ولوحات أجار، أجار ز 20 إضافية.
   4. إضافة 250 مل ماء الصنبور وتذوب المكونات.
   5. أعد اﻷوتوكﻻف كل وسائل الإعلام بشكل منفصل في 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
   6. لوحات أجار، والجمع بين 250 مل متوسطة رطل مع 750 مل من البحر الاصطناعي المياه المتوسطة مباشرة بعد التعقيم وإعداد لوحات.
   7. للسائلة المتوسطة، الجمع بين 250 مل متوسطة رطل مع 750 مل من البحر الاصطناعي المياه المتوسطة مباشرة بعد التعقيم أو عند تبريده.
      ملاحظة: قد تحصل المتوسطة مياه البحر الاصطناعي عكر عن طريق ترسيب الملح.
2. متتالية السلالات البكتيرية طرحه على لوحات أجار المتوسط مياه البحر الاصطناعي واحتضان بين عشية وضحاها في 24-30 درجة مئوية.
   ملاحظة: التخزين منذ وقت طويل من السلالات البكتيرية عادة ما يتحقق من خلال تجميد الأرصدة والغليسيرول ثقافة البكتيرية. وينبغي أن السنة اللهب دائماً أثناء سلالات في لوحات أجار أولاً لضمان شروط انطلاق موحدة لجميع سلالات، قبل الاستخدام للثقافات السائل، بسبب مرحلة تأخر في النمو بعد ذوبان الجليد.
3. إعداد قدو بتطعيم 100 مل البحر الاصطناعي المياه المتوسطة مع مستعمرة واحدة من اللوحة. احتضان قدو في 24-30 درجة مئوية و 120 دورة في الدقيقة في شاكر حاضنة بين عشية وضحاها.
4. تلقيح 800 مل من البحر الاصطناعي المياه المتوسطة مع 8 مل قدو.
5. احتضان الخلايا البكتيرية في 24-30 درجة مئوية و 120 دورة في الدقيقة في شاكر حاضنة.
   ملاحظة: يختلف التشكيل الجانبي كثافة الضوء من البكتيريا طرحه بقوة مع درجة الحرارة. اعتماداً على الآليات التنظيمية لإنتاج الضوء من السلالة البكتيرية منها، قد تبدأ الانبعاثات الخفيفة بعد حوالي 1-6 ح.
6. مراقبة زراعة الخلايا البكتيرية حتى يبدأون الساطع (حوالي ح 1-6).
   ملاحظة: استناداً إلى غرض التعبير، الخلايا تزرع حتى اليوم التالي ويتم حصادها بعد ذلك، أو يمكن أن تكون الخلايا أبقى تهز طالما أنها هي مشرقة. يمكن أن يتم جمع الخلايا وتنقية البروتينات أي وفقا للإجراءات المعيارية.

4. في فيفو مقايسة النشاط للسلالات البكتيرية طرحه وسلالات معدلة كولاي

ملاحظة: عادة ما يكون مخزن منذ وقت طويل من سلالات أسييفيد من خلال تجميد الأرصدة والغليسيرول ثقافة البكتيرية. وينبغي أن السنة اللهب دائماً أثناء سلالات في لوحات أجار أولاً لضمان شروط انطلاق موحدة لجميع سلالات، قبل الاستخدام للثقافات السائل، بسبب مرحلة تأخر في النمو بعد ذوبان الجليد.

1. خط السلالة البكتيرية المطلوب طرحه أو تعديل كولاي سلالة على صفيحة أجار واحتضان عند 28 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
   ملاحظة: درجة حرارة الحضانة يمكن أن تختلف من سلالة إلى سلالة، وقد يتم تقييم تجريبي. لتكون قادراً على مقارنة السلالات البكتيرية طرحه وتعديل سلالات كولاي ، ظروف النمو يجب أن تكون متطابقة.
2. تطعيم 3 مل متوسطة مع سلالة كل منهما مع مستعمرة واحدة من صفيحة أجار واحتضان الخلايا في 28 درجة مئوية و 180 دورة في الدقيقة في شاكر حاضنة لحوالي 1-2 ح.
3. قياس كثافة الخلية 01:10 إضعاف ثقافة السائل في 650 نانومتر. حساب نسبة وحجم للثقافة 1 مل مع OD₆₅₀ 0.05.
   ملاحظة: مقايسة قارئ لوحة اللاحقة سيتم تحديد كثافة الخلية في 650 نانومتر على تجنب التدخل بسبب انبعاث الضوء السلالات.
4. "الماصة؛" حجم المحسوبة للثقافة والمتوسطة إلى لوحة الجدران الأسود 24-جيدا مع الزجاج السفلي. لتعديل كولاي سلالة، وإضافة 1 ميليلتر من كاناميسين (المقاومة للمضادات الحيوية لمكافحة ناقلات pET28a) و 1 ميليلتر من إيبتج (تنظيم دورات تعريفية للتعبير الجيني) للعينات. ضع غطاء على اللوحة لتجنب التبخر أثناء القياسات.
   ملاحظة: لضمان أن لا تضيع متجه pET28a التي تحتوي على مشغل كامل لوكس بثقافة كولاي ، كاناميسين يجب أن تضاف إلى كل عينة كولاي في الآبار لوحة وأؤكد أن إنتاج الضوء من كولاي ويمكن قياس الخلايا، يجب أن يكون التعبير الجيني الناجمة عن إيبتج. تجنب التدخل في الحديث المتبادل والقياس، أسود الجدران لوحات جيدا مع أسفل الزجاج وغطاء شفاف وأظهرت نتائج أفضل. ومع ذلك، يمكن ملاحظة الحديث المتبادل ومواقف جيدا يجب أن يتم اختياره بعناية.
5. بدء القياس في قارئ لوحة.
   ملاحظة: تستند البروتوكول قارئ لوحة نصي وضعت خصيصا لهذا التحليل (انظر مواد تكميلية) الذي يجمع بين اثنين من القياسات، وامتصاص والإضاءة الحيوية. نقاط بيانات يتم جمعها كل 10 دقيقة مع الرج الدائم بين القياسات ودرجة حرارة ثابتة 28 درجة مئوية.

ترتيب الجينات مشغل لوكس - لوكسكدابفيج -هو يحافظ عاليا عبر مختلف سلالات^2،،من⁵¹⁴. لتصميم بلازميد، تسلسل المعلومات مأخوذة من سلالة بكتيرية طرحه ماندابامينسيس فوتوباكتيريوم 27561 وأبقى في ترتيب الجينات نفسها، وأيضا، اعتبرت تسلسل فضله بين جينات مفردة. نظرة تخطيطية استراتيجية الاستنساخ جيبسون التطبيقية هو مبين في الشكل 2. وقد تولدت الأجزاء الأربعة في المجموع، لوكسكداب، و مبلغ، لوكسيج، و ريبيبه، مع 20-40 زوج قاعدي تداخل متواليات. بعد اتباع جميع الخطوات ل الجمعية جيبسون²⁰، تسلسل الحمض النووي أكدت التجميع الصحيح من بلازميد، بما في ذلك كافة الأجزاء. خريطة متجه pET28a المنتج النهائي الجمعية التي تحتوي على مشغل لوكس-الضلع هو مبين في الشكل 3. ميزة كبيرة من ناقلات pET28a تعديل هذا هو الاستفادة من توحيد شروط النمو كولاي والتحكم التوجيهي مع إيبتج.

لقياس الانبعاثات الخفيفة من البكتيريا طرحه وكثافة الخلايا الخاصة بكل منها، تم تطوير أسلوب قارئ على أساس لوحة. تم إنشاء الأسلوب للقارئ لوحة الجمع بين البرامج النصية لقياس واحد لكثافة كثافة وخلية خفيفة. مكن هذا البرنامج النصي رواية قياس OD₆₅₀ وكثافة الضوء كل 10 دقيقة لمستخدم تحديد الإطار الزمني، الذي قد يتعين تعديلها للوقت الجيل من البكتيريا المستخدمة في تحليل كل منها (مثلاً، ح 10). تم إجراء قياس الكثافة البصرية على 650 نانومتر لتجنب التداخل مع انبعاث الضوء. كدليل على مفهوم وأن أؤكد الصحة وسلوك النمو الصحيح للخلايا كولاي ، أجريت قياسات مرجعية. ويرد في الشكل 4 مقارنة كولاي BL21 الخلايا والخلايا BL21 كولاي التي تحتوي على متجه فارغة pET28a كولاي BL21 الخلايا التي تحتوي على ناقل pET28a مع مشغل لوكس-الضلع إدراج. لسلالة الأخير، تمت إضافة لا إيبتج لتحليل انبعاث الضوء بسبب يجتازها المروج T7. إظهار كافة القياسات المرجعية الثلاثة منحنى نمو سيجمويدال مع ثلاث مراحل النمو (المرحلة متخلفة، الأسى وثابتة). حيث يتم التعبير الناجم عن إضافة إيبتج والضوء ينبعث فقط الخلايا BL21 كولاي التي تحتوي على ناقل pET28a مع بدء إدراج مشغل لوكس-الضلع ينبعث الضوء، ولكن على النقيض من القياسات بعد 30 دقيقة، الخلايا المستحثة ابدأ فقط تلميع بعد حوالي 5 ساعات، وتظهر انبعاثات خفيفة أقل بكثير (ca. النوبات) بالمقارنة مع نظام المستحث.

الرقم 5 يعطي مقارنة منحنيات النمو وكثافة الضوء من مشغل لوكس المعرب عنها في كولاي والسلالة البكتيرية طرحه ماندابامينسيس P. 27561، أما في رطل المتوسطة أو المتوسطة مياه البحر الاصطناعي، استخدام الرواية إنشاء أسلوب في الموقع . لمقارنة هذه البكتيريا، وأجريت القياسات في درجة حرارة حضانة 28 درجة مئوية. هذا يقلل درجة الحرارة معدل نمو معدلة كولاي سلالة المتوسط رطل وكذلك المتوسطة مياه البحر الاصطناعي، ولكن للسلالات البكتيرية طرحه انخفاض درجات الحرارة ذات أهمية حاسمة. هذا الاعتماد على درجة الحرارة مرئياً في الشكل 5ألف، كما يبين ماندابامينسيس P. 27561 بكثافة خلية أعلى بكثير مما كولاي. وعلاوة على ذلك، يسمح المتوسطة رطل بينما بالنسبة لسلالات كولاي ، جيل من أعلى الكثافات الخلية، للسلالات البكتيرية الطبيعية طرحه، البحر الاصطناعي المياه المتوسطة المفضلة والأساسية للإضاءة الحيوية. ترتبط كثافة الخلية مسجل بالكثافات الخفيفة الخاصة بكل منها، كما هو موضح في الشكل 5ب. الجديرة بالذكر، طرحه كولاي خلايا مماثلة تصل الضوء ماكسيما الانبعاثات في كلا المتوسطة مياه البحر المتوسط فضلا عن اصطناعية رطل، على الرغم من كثافة أعلى وسجلت في نقاط زمنية مختلفة. وعلى النقيض من هذه الملاحظة، ماندابامينسيس P. 27561 قابلة للبقاء مع معدلات النمو انخفاض كبير في متوسط رطل، ولكن الخلايا البكتيرية لا ينبعث الضوء في كل (الشكل 5ب). في وسط مياه البحر الاصطناعي، يظهر ماندابامينسيس P. 27561 كحد أقصى للانبعاثات الخفيفة في حوالي 1 × 10⁴ تهم في الثانية، وعامل ما يقرب من 200 أقل من كولاي. الشكل 5 ج تمثل وحدات خفيفة النسبي حيث يتم تطبيع الإضاءة الحيوية حسب التوجيه التشغيلي. وتؤكد هذه النتائج أنه تم إدراج بلازميد يحتوي على مشغل لوكس في كولاي ناجحة والوظيفية، بل أيضا أن هذا التعديل كولاي سلالة بديل صالح مع الانبعاثات الخفيفة حتى أعلى غلة ودون الحد من الإضاءة الحيوية البكتيرية البكتيريا مارينا، مثل مياه البحر معقدة درجة حرارة متوسطة ومنخفضة.

بالإضافة إلى ذلك، تم إجراء قياس طويلة الأجل للتعبير الجيني لوكس-الضلع كولاي على أساس أكثر من 24 ساعة لتحليل طول العمر لانبعاث الضوء (الشكل 6). استمر انبعاث الضوء ح 19.5، أطول بكثير من السلالات البكتيرية (مثلاً، P. ماندابامينسيس 27561) حيث انخفاض تدريجي لوحظ أدى إلى انبعاث الخفيفة منخفضة جداً بعد ح 10.

لتوضيح أوجه قصور التحليل المتقدمة، يبين الشكل 7 نتائج القياس من السلالات البكتيرية طرحه ثلاثة، هي: S1 ماندابامينسيس فوتوباكتيريوم ، ماندابامينسيس فوتوباكتيريوم TH1 و الضمة هارفي 14126. للسلالة الأولى (S1)، الأسلوب الذي يعمل بشكل جيد جداً ويدل شدة الإضاءة الحيوية قصوى حوالي 2 × 10⁶. لأخرى اثنان سلالات (TH1 و 14126)، لا يمكن تحديد شدة الضوء القصوى نظراً لشدة الضوء التي تم إنشاؤها بواسطة كل تجاوز حد الكشف عن إعدادات الأداة المستخدمة. تم تعيين قيمة كسب المعرفة للأسلوب المتقدمة (برنامج نصي) لهذه السلالات اثنين عالية جداً. ومع ذلك، يمكن مقارنة بداية النشاط الإضاءة الحيوية مع بعضها البعض. ماندابامينسيس P. TH1 و S1 ماندابامينسيس P. ابدأ مشرقة بعد حوالي 1 ح وقيمتها₆₅₀ OD 0.1-0.2، على التوالي. وفي المقابل، ف هارفي 14126 يبدأ ينبعث الضوء بعد حوالي 5.5 ح بقيمة₆₅₀ OD 1.0. لاحظ بداية انبعاث الضوء هو مصحوبا بزيادة هائلة في التطوير التنظيمي، فضلا عن الإضاءة الحيوية. ومن المعروف أن الإضاءة الحيوية هارفي ف 14126 وراء النصاب الاستشعار عن التنظيم وذا خلية محددة كثافة مما يتيح تفعيل مشغل لوكس ، الذي يمكن ملاحظته من الواضح في الشكل 7¹³. يوضح هذه النتيجة أن المقايسة قارئ لوحة من الممكن بسهولة مقارنة طرحه البكتيريا وأيضا نحو تحديد إليه تنظيمية لهذه السلالات بتحديد ما إذا كان النصاب الاستشعار عن التنظيم يمكن أن تكون مع هذه الرواية في الموقع ولاحظت أم لا.

الشكل 8 يبين مثال على ثقافة التعبير من الخلايا BL21 كولاي إيواء بلازميد pET28a المجمعة التي تحتوي على مشغل لوكس بعد التعريفي مع إيبتج. بعد حوالي ساعة واحدة بعد التعريفي، تبدأ الخلايا كولاي مشرقة بلون الأزرق والأخضر. الشكل 8 أ يظهر التعبير كولاي صورت الثقافة في الضوء ويعطي الرقم 8ب ثقافة نفسه في الظلام. الشكل 8 ج يصور صفيحة أجار البحر الاصطناعي المياه المتوسطة مع S1 ماندابامينسيس P. متوهجة في الظلام في نفس خاصية اللون الأخضر والأزرق للإضاءة الحيوية البكتيرية.

الشكل 2 : التمثيل التخطيطي جيبسون التطبيقية الاستنساخ لأغراض استراتيجية. خطوة (ط): صممت الإشعال المتداخلة (الأسهم الملونة؛ ca. تداخل زوج قاعدي 20-40). كبسولة تفجير متداخلة تحتوي على تسلسلات انلينغ تتكون من منطقة 5 'و 3' كل منهما في جزء واحد ومنطقة كل منها 3 'و 5' الجزء المجاور. الخطوة (ثانيا): يتم إنشاء أجزاء مصممة للجمعية عبر ردود الفعل PCR القياسية. الخطوة (ثالثا): هو خطيا ناقلات الأمراض المستهدفة بتقييد الهضم (مثلاً نكوي، زهوي). الخطوة (رابعا): تركيزات الحمض النووي لجميع الأجزاء وناقلات خطية يجب أن تكون مصممة على ضبط تركيز مناسب للجمعية جيبسون (وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة). الخطوة (ت): كافة الأجزاء وناقل خطية مع تركيزات الحمض النووي الأمثل، جنبا إلى جنب مع جيبسون الجمعية مزيج الرئيسي ([ااكسونوكلس] T5 وبوليميراز الدنا DNA ligase) وهي المحتضنة عند 50 درجة مئوية حاء 1 خطوة (سادسا): تتحول الجمعية المنتج وفقا للبروتوكولات القياسية في مناسبة كولاي سلالة عالية الغلة بلازميد النسخ المتماثل (مثلاً، كولاي TOP10 أو XL-1). خطوة (السابع): للتحقق من التجميع الصحيح بلازميد، قد تسلسل الحمض النووي بلازميد المجمعة التي يتعين القيام بها. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3 : خريطة متجه من pET28a التي تحتوي على مشغل لوكس-الضلع - يتم إدراج مشغل لوكس-الضلع من ماندابامينسيس P. 27561 في موقع pET28a في ترتيب الجينات الأصلية (لوكسكدابفيج-ريبيبه) الاستنساخ لأغراض متعددة. يتم تقييد المواقع المستخدمة لاستنساخ نكوي وزهوي. هي الأجزاء المستخدمة للجمعية جيبسون لمشغل لوكسكداب في أورانج، مبلغ باللون الأخضر، لوكسيج باللون الأزرق، و ريبيبه في الخزامى؛ تظهر الجينات داخل جزء كمربع منفصل. تسلسلات فضله بين كل الجينات مشغل مدرجة في استراتيجية الاستنساخ المطبقة. حجم بلازميد النهائي pET28a التي تحتوي على مشغل كامل لوكس-الضلع زوج قاعدي 14,625. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4 : مقارنة بين منحنيات النمو وكثافة الضوء من السلالات المرجعية. OD في 650 نانومتر وشدة الإضاءة الحيوية في التهم الموجهة إليه في الثانية تم قياس كل 10 دقيقة أكثر من 10 ح عند 28 درجة مئوية. جميع القياسات قيم المتوسط الحسابي لثلاثة replicates البيولوجية مع أربعة replicates التقنية كل. أشرطة الخطأ تمثل الانحرافات المعيارية. كولاي الخلايا BL21 (مربعات رمادية)، BL21 كولاي الخلايا التي تحتوي على pET28a فارغة مكافحة ناقلات (دوائر رمادية)، وحللت كولاي BL21 الخلايا التي تحتوي على ناقل pET28a مع إدراج مشغل لوكس-الضلع (الماس الأسود) إلى ضمان النمو الصحيح سلوك خلايانا كولاي . الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- 

الشكل 5 : مقارنة منحنيات النمو وكثافة الضوء من مشغل لوكس المعرب عنها في كولاي (المربعات) و ماندابامينسيس P. 27561 (الدوائر) في المتوسط رطل (الرموز مفتوحة) أو المتوسطة مياه البحر الاصطناعي (رموز شغلها). جميع القياسات قيم المتوسط الحسابي لثلاثة replicates البيولوجية مع أربعة replicates التقنية كل. أشرطة الخطأ تمثل الانحرافات المعيارية. أجريت جميع التجارب في درجة حرارة حضانة 28 درجة مئوية. قياسات الكثافة (OD) البصري (A) في 650 نانومتر أجريت كل 10 دقيقة ل h. 10 لوكس كولاي مشغل التعبير (اللوحة اليسرى) هو مقارنة مع ماندابامينسيس P. 27561 (اللوحة اليمنى) في وسط مياه البحر المتوسط ومصطنعة رطل. كثافة الخلية مصممون على 650 نانومتر لتجنب التدخل الإضاءة الحيوية. (ب) قياس شدة الضوء (الإضاءة الحيوية [التهم/s]) قد أنجز كل 10 دقيقة لهو مقابل 10 حاء لوكس كولاي مشغل التعبير (اللوحة اليسرى) ماندابامينسيس P. 27561 (اللوحة اليمنى) في رطل البحر المتوسط والاصطناعية المياه المتوسطة. الضوء (ج) النسبية كثافات (رلو/OD) لمشغل لوكس المعرب عنها في كولاي (اللوحة اليمنى) و ماندابامينسيس P. 27561 (اللوحة اليمنى) تتحدد بتطبيع الإضاءة الحيوية لكثافة الخلية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الرقم 6 : مقارنة منحنيات النمو وكثافة الضوء كولاي على أساس التعبير الجيني لوكس على 24 h. OD في 650 نانومتر وشدة الإضاءة الحيوية في التهم الموجهة إليه في الثانية تم قياس كل 10 دقيقة أكثر من 24 ساعة في 28 درجة مئوية. جميع القياسات قيم المتوسط الحسابي لثلاثة replicates البيولوجية مع أربعة replicates التقنية كل. أشرطة الخطأ تمثل الانحرافات المعيارية. بالإضافة إلى ذلك، يتم تمثيل الكثافات الخفيفة النسبي (رلو/OD) حيث يتم تطبيع الإضاءة الحيوية بكثافة الخلية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 7 : مقارنة بين البكتيريا طرحه لتقييم النصاب القانوني المحتمل الاستشعار عن التنظيم- انبعاث الضوء وكثافة الخلية تقاس كل 10 دقيقة ح 10 وتمثل قيم المتوسط الحسابي لثلاثة replicates البيولوجية مع أربعة replicates التقنية كل. أشرطة الخطأ تمثل الانحرافات المعيارية. قياسات TH1 ماندابامينسيس فوتوباكتيريوم (المربعات السوداء)، هارفي الضمة 14126 (دوائر رمادية) وماندابامينسيس فوتوباكتيريوم S1 (الماس الرمادي) مقارنة ببعضها البعض؛ (أ) يصور الكثافة البصرية (OD) في 650 نانومتر، (ب) على ضوء كثافة (الإضاءة الحيوية [التهم/s])، وكثافة الضوء النسبي (ج) (رلو/OD). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 8 : الإضاءة الحيوية في وسائل الإعلام السائلة وعلى لوحات أجار. (أ) تلقيح قارورة 5 ل مع ل 2 رطل المتوسطة مع الخلايا BL21 كولاي معربا عن بلازميد مشغل لوكس pET28a صورت في ضوء. (ب) نفس الثقافة كما هو الحال في (أ) تصوير في الظلام. تم التقاط الصور A و B حوالي 2 ح بعد التعريفي للتعبير. (ج) المياه البحر الاصطناعي لوحة أجار متوسطة مع السنة اللهب أثناء ثقافة S1 ماندابامينسيس P. تصويره في الظلام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

وقد تحقق بناء التعبير بلازميد يحتوي على أربعة أجزاء تأليف مشغل كامل لوكس-الضلع من ماندابامينسيس P. 27561 عبر جيبسون الاستنساخ. ويتيح هذا التعبير الجيني لوكس كولاي على أساس الخلايا كولاي ينبعث الضوء. تجنب النصاب الاستشعار عن التنظيم وظروف نمو قياسي بمميزات كبيرة لهذا النظام.

مزايا استخدام استراتيجية الاستنساخ جيبسون هي الجمعية سهلة من شظايا متعددة من الحمض النووي الخطي ومرونة عالية ولا حاجة لقيود محددة المواقع^18،19،20. يسمح هذا الأسلوب بسهولة تغيير مشغل لوكس ، باستثناء الجينات مفردة أو مجموعات الجينات أو إدخال جينات جديدة أو تبادل الجينات من سلالة واحدة مع آخر. شرط أساسي لتطبيق هذا الأسلوب هو توافر التسلسل الجيني مشغل كل منهما لوكس . إلا لعدد قليل من البكتيريا طرحه هو تسلسل الحمض النووي الكامل لمشغل كل منهما لوكس المعروفة و/أو المتوفرة. العديد من هذه التسلسلات مجزأة نظراً لأنها تم إنشاؤها باستخدام تسلسل بندقية. وفي حالة التحقيق ماندابامينسيس P. 27561 تسلسل الحمض النووي الكامل لمشغل لوكس المعروفة والمتاحة من قاعدة بيانات جينية نكبي (بنك الجينات: DQ988878.2).

واحد خطوة حاسمة في البروتوكول للجمعية جيبسون هو حساب تركيز الحمض النووي من أجزاء مفردة. في بروتوكول الجمعية من الشركة المصنعة وأوصى بأن تستخدم 0.2-0.5 بمولس وإجمالي حجم 20 ميليلتر ل 4-6 أجزاء^20،21. في حالتنا هذه، حيث تتكون من أجزاء 4 لوكسكدابفيج-ريبيبه ، تركيزات وإجمالي حجم كانت بمول 0.1 و 45 ميليلتر، على التوالي، تبعاً لإنتاج منتجات PCR. من ناحية، قد التركز تخفيض، ومن ناحية أخرى، كان الحجم زيادة. ومع ذلك، عملت الجمعية جيدا وتسلسل الحمض النووي أكدت الإدراج الصحيحة في المحاولة الأولى. وأكدت هذه النتيجة الجمعية جيبسون كوسيلة قوية ومناسبة لتحقيقاتنا، التي يمكن بسهولة تعديل^18،،من¹⁹²⁰.

والرزن قارئ لوحة المنشأة حديثا وسيلة سهلة للتعامل مع الأسلوب. فإنه يمكن تحليل أساسي بسيط من جديد أو (الأمم المتحدة-) معروف طرحه السلالات البكتيرية ويعطي الفعل تلميحاً أولى في الآلية التنظيمية لإنتاج الخفيفة (مثل التأخر في التﻷلؤ في الخلية منخفضة الكثافة). بالإضافة إلى ذلك، يمكن تقييم ظروف النمو في تركيبة مع إنتاج الضوء بسهولة بمجرد تغيير المتوسطة النمو أو درجة الحرارة.

وأجريت القياسات مع قارئ لوحة عند 28 درجة مئوية. والسبب في هذا الإعداد غير عادية هو حساسية درجة الحرارة من السلالات البكتيرية طرحه، حيث تؤدي درجات حرارة فوق 30 درجة مئوية إلى أقل أو حتى أي النمو و/أو انبعاث الضوء. ملاحظة، أن القارئ لوحة قادر على إبقاء درجة حرارة محددة على مر الزمن مع الحد من مفقود النشطة في نظام التبريد. ولذلك، درجة الحرارة المحيطة يجب أن يكون تحت درجة حرارة القياس.

كدليل على المفهوم، المقارنة بناء كولاي مع الضغط الذي طرحه ماندابامينسيس P. (الشكل 5)، من الجهة والمقاييس المرجعية (الشكل 4) من ناحية أخرى تم تنفيذها وتأكيد موثوقية هذا النظام المنشأة حديثا. بالإضافة إلى ذلك، أكد قياس المدى الطويل لطول العمر لانبعاث الضوء (الشكل 6). ولكن يتعين على المرء أن ينظر أن قيم التطوير التنظيمي لا يمكن التعويل عليها أعلاه بكثافة بصرية معينة، تبعاً لخصائص الجهاز القياس المستخدمة (حوالي 15 ح في هذه الحالة) حيث يلزم تمييع مناسبة لقياس في مجموعة الخطي كاشف. هذه الفروق عالية في قيم التطوير التنظيمي تجعل هذه القياسات منذ وقت طويل لا يمكن الاعتماد عليها. ولذلك ينصح القياسات أقصر مثل ح 10 باستخدام الإعداد التجريبية ذكرت هنا.

القيود المفروضة على مقايسة قارئ لوحة ثابتة يتبين في الشكل 7. تكمن الصعوبة في إيجاد بيئة مناسبة للقياس. 'اكتساب القيمة' ضبط حساسية أنبوب مضاعف صور (PMT). المكسب هو تضخيم الإشارة في PMT، بمعنى أن زيادة عامل كسب أعلى الإشارة. إذا الكسب يتم تعيين منخفض جداً، وإشارة إلى نسبة الضوضاء يصبح أكبر وكثافة الضوء من البكتيريا طرحه ساطع "منخفض" لا يمكن أن يقاس أي أكثر (إشارات قريبة من الصفر، المعطيات غير معروضة). التحدي في مقايسة طرحه للكسب ذلك نتائج القياس لجميع السلالات البكتيرية البقاء داخل نطاق الصك. بالإضافة إلى ذلك، يتوقف نطاق القياس التﻷلؤ على قياس الفاصل الزمني للوقت (مثلاً الحد الأقصى من 2,000,000 1 ق).

وكان تعيين الكسب إلى 2800، الذي كان اختباره تجريبيا والمختار للقارئ لوحة المحددة المستخدمة لإنشاء هذا الأسلوب. يسمح الإعداد مكسب المستخدمة تسجيل الحد الأقصى من الضوء المنبعثة من طرحه النظام كولاي و ماندابامينسيس P. 27561 S1 ماندابامينسيس P. دون تجاوز، ولكن لسلالات TH1 P. ماندابامينسيس و خامسا-هارفي 14126 الكسب مرتفع جداً. ولذلك، هذه السلالات الأخيرة يتجاوز حد الكشف ولا يمكن قياس شدة الضوء القصوى الحقيقية. قد يمنع هذا التقييد التقنية مقارنة طرحه البكتيريا، والتي تظهر اختلافات كبيرة في الانبعاثات الخفيفة كحد أقصى، على الرغم من أن ظروف النمو وكثافة الخلية قد تكون قابلة للمقارنة.

الموضع من السلالات البكتيرية تم تحليلها داخل لوحات جيدا المستخدمة قد يتم تقييم تجريبي. على الرغم من أن استخدمت الأسود لوحات جيدا مع الزجاج القيعان، لوحظ الحديث المتبادل بين العينات. كثافة الضوء من سلالات محددة مرتفع جداً، أن جميع الآبار المجاورة سوف تظهر انبعاثات الخفيفة إيجابية كاذبة (مثلاً، فارغة). ولذلك، من المهم لقياس اثنين من سلالات مختلفة أما بشكل منفصل أو مع بعض فصل المكاني لبعضها البعض.

هناك بالفعل العديد من تعديل لسلالات كولاي المعروفة التي تحتوي على أجزاء من مشغل لوكس وهي أساسا موجهة نحو تطبيق^15،،من¹⁶¹⁷. وتهدف الأساليب الموصوفة هنا، البحوث الأساسية، وعلى سبيل المثال إمكانية تحليل الجينات لوكس كل على حدة. على الرغم من أن البحوث المتعلقة بالإضاءة الحيوية لها تاريخ طويل، إلا أنه لا تزال هناك العديد من الأسئلة المفتوحة. باستثناء إدخال جينات من مشغل لوكس ، تبادل الجينات لوكساب مع الجينات من سلالة أخرى، أو تحليل البروتين المجمعات، جزءا لا يتجزأ من السهل للتعامل مع نظام كولاي والمضي في تطبيق لوحة تحليل القارئ، قد يكون من الممكن للحصول على مزيد من المعلومات عن العمليات التنظيمية والمهام للجينات لوكس .

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

نود أن نشكر ولاديسلاو ماير (بي أم جي لابتيتش GmbH) لدعمه في إنشاء البرنامج النصي الذاتي مكتوب للقارئ لوحة. أيد هذا العمل النمساوي "Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung" (FWF) إلى الساعة (P24189) وبرنامج الدكتوراه "كمبوتشيا الديمقراطية جزيئية علم الإنزيمات" (W901) إلى بعد الظهر.