NMR-Spektroskopie als robustes Werkzeug für die schnelle Bewertung des Lipidprofil von Fischöl

Hier hochauflösenden ¹ H und ¹³ C - Kernresonanzspektroskopie (NMR) wurde als ein schnelles und zuverlässiges Werkzeug für die quantitative und qualitative Analyse von verkapselten Fischölergänzungen verwendet.

Die westliche Ernährung ist arm an n - 3 - Fettsäuren, also der Verzehr von Fischöl empfohlen wird , um die Aufnahme dieser essentiellen Nährstoffe zu erhöhen. Das Ziel dieser Arbeit ist es, die qualitative und quantitative Analyse von verkapselten Fischtranergänzungen unter Verwendung hochauflösender ¹ H und ¹³ C - NMR - Spektroskopie unter Verwendung von zwei verschiedenen NMR - Instrumente zu demonstrieren; Ein 500 MHz und einem 850 MHz-Instrument. Sowohl Proton ⁽¹ H) und Kohlenstoff ⁽¹³ C) NMR - Spektren können zur quantitativen Bestimmung der Hauptbestandteile der Fischölergänzungen verwendet werden. Die Quantifizierung der Lipide in Fischöl wird durch die Integration der entsprechenden NMR-Signale in den entsprechenden 1D-Spektren erreicht. Ergebnisse von ¹ H und ¹³ C - NMR sind in guter Übereinstimmung miteinander erhalten wird , trotz der Unterschiede in der Auflösung und die Empfindlichkeit zwischen den beiden Kernen und den beiden Instrumenten. ¹ H NMR Angebotsa schnellere Analyse im Vergleich zu ¹³ C - NMR, als das Spektrum in weniger als 1 min aufgezeichnet werden, im Gegensatz zu ¹³ C - NMR - Analyse, die von 10 min bis eine Stunde dauert. Das ¹³ C - NMR - Spektrum ist jedoch viel informativer. Es kann für eine größere Anzahl von einzelnen Fettsäuren quantitative Daten zur Verfügung stellt und kann zur Bestimmung der Positionsverteilung von Fettsäuren auf dem Glycerin-Backbone verwendet werden. Beide Kerne können in quantitative Informationen liefern nur ein Experiment, ohne die Notwendigkeit der Reinigung oder Trennschritte. Die Stärke des Magnetfeldes vor allem die Spektren ¹ H NMR wirkt aufgrund seiner geringeren Auflösung mit Bezug auf ¹³ C NMR jedoch auch geringer Kosten NMR Instrumente effizient als Standardverfahren der Lebensmittelindustrie und die Qualitätskontrolle Laboratorien angewandt werden können.

Der Verbrauch von n - 3 - Fettsäuren in der Nahrung hat sich als vorteilhaft gegen mehrere Bedingungen sein , wie beispielsweise Herzerkrankungen ^{1, 2, 3, 4} und entzündlichen Erkrankungen Diabetes ^5. Die westliche Ernährung ist in n - 3 - Fettsäuren als arm und damit der Verbrauch von Fischöl empfohlen wird , um die n -6 / n -3 Gleichgewicht in Verbraucherernährung ¹ zu verbessern. Trotz der jüngsten Zunahme der Fischtranergänzung Verbrauch, bleiben Fragen über die Sicherheit, Authentizität und Qualität einiger dieser Produkte. Die schnelle und genaue Analyse der Zusammensetzung von Fischöl ist wichtig, um richtig die Qualität dieser kommerziellen Produkte zu bewerten und die Sicherheit der Verbraucher zu gewährleisten.

Die am häufigsten verwendeten Methoden zur Bewertung von Fischöls sind Gaschromatographie (GC) und Infrarotspektroskopie (IR). Während diese hochsensible Methoden sind, leiden sie unter verschiedenen Nachteilen ^6. Die GC - Analyse ist zeitaufwendig (4-8 h) , da die Trennung und Derivatisierung von einzelnen Verbindungen erforderlich ⁷ und Lipidoxidation kann bei der Analyse ^{8, 9} auf. Während der IR - Spektroskopie quantitativ sein kann, wird ein Vorhersagemodell unter Verwendung von Partial Least Squares Regression (PLSR) konstruiert werden benötigt, obwohl es Ausnahmen gibt , in denen IR - Banden können ¹⁰ zu einer einzigen Verbindung zugeschrieben werden. PLSR erfordert die Analyse einer großen Anzahl von Proben, die ¹¹ , um die Zeit der Analyse erhöht. Aus diesem Grunde gibt es ein zunehmendes Interesse an der Entwicklung neuer analytischer Methoden, die genaue und schnelle Analyse einer großen Anzahl von Fischölproben ermöglichen. Organisationen wie der Office von Nahrungsergänzungsmitteln (ODS) an dem National Institutes of Health (NIH) und die Food and Drug Administration (FDA) hat mit der Association of Official Analytical Chemists (AOAC) zusammengearbeitet , diese neuen Methoden ¹² zu ^{entwickeln, 13.}

Eine der vielversprechendsten analytischen Methoden für das Screening und die Auswertung von Mehrkomponenten - Matrizen, wie beispielsweise Nahrungsergänzungsmittel ist, Nuclear Magnetic Resonance (NMR) -Spektroskopie ^{14, 15.} NMR-Spektroskopie hat mehrere Vorteile: es ist eine nicht-destruktive und quantitative Technik, es ohne Probenvorbereitung minimal erforderlich ist, und es wird durch eine hervorragende Genauigkeit und Reproduzierbarkeit gekennzeichnet. Darüber hinaus ist die NMR-Spektroskopie eine umweltfreundliche Methode, da sie nur geringe Mengen an Lösungsmitteln verwendet. Der Hauptnachteil der NMR-Spektroskopie ist seine relativ geringe Empfindlichkeit im Vergleich zu anderen analytical Methoden haben jedoch die jüngsten technologischen Fortschritte in der Instrumentierung, wie beispielsweise stärkere Magnetfelder, kryogenen Sonden mit verschiedenen Durchmessern, fortschrittliche Datenverarbeitung, und vielseitige Pulssequenzen und Techniken, um die Empfindlichkeit bis zu nM-Bereich erhöht. Während NMR Instrumentierung hohen Kosten ist, senken die lange Lebensdauer von NMR-Spektrometern und die vielen Anwendungen der NMR die Kosten für die Analyse auf lange Sicht. Dieses detaillierte Video - Protokoll sollte neue Praktiker auf dem Gebiet helfen , Gefahren mit ¹ H und ¹³ C - NMR - spektroskopische Analyse von Fischölergänzungen assoziiert zu vermeiden.

1. NMR-Probenvorbereitung

Hinweis: Achtung, wenden Sie sich bitte alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (MSDS) vor dem Gebrauch. Deuteriertem Chloroform (CDCl ₃₎ bei der Probenherstellung verwendet wird , ist toxisch. Bitte verwenden Sie alle geeigneten Praktiken Sicherheit bei der Probenvorbereitung einschließlich der Verwendung einer Abzugshaube und persönliche Schutzausrüstung durchführen (Schutzbrille, Handschuhe, Kittel, in voller Länge Hosen, geschlossene Schuhe).

1. Herstellung von ¹ H und ¹³ C - Proben
   1. Extrahieren 120 ul (~ 110 mg) von Fischöl aus einer Nahrungs Kapsel unter Verwendung einer Spritze und gibt ihn in ein 4 ml-Glasfläschchen. Das Gewicht des Fischöls.
   2. Probe Auflösung
      1. Man löst etwa 120 & mgr; l von Fischöl in 500 ul CDCl ₃ , enthaltend 0,01% Tetramethylsilan (TMS) , das als Referenz für die ¹ H und ¹³ C - chemische Verschiebungen verwendet wird.
         HINWEIS: TMS ist die Verwendungd nur für die chemische Verschiebung der Kalibrierung nicht für die Quantifizierung (siehe Schritt Nummern 2.2.1.3 und 2.2.2.3) Zwecke (Schrittnummern 2.2.1.2.7 und 2.2.2.2.7 sehen).
      2. Vorbereiten einen 2,6-Di - tert - butyl-4-methylphenol (BHT) Stammlösung, falls die Quantifizierung , ausgedrückt in mg / g erwünscht ist , um etwa 220 mg BHT Lösen und 15 mg Chrom (III) -acetylacetonat (Cr ( acac) ₃₎ in 20 ml CDCl ₃ 0,01% TMS enthält. Verwenden 500 & mgr; l der Stammlösung von 100 mg (± 10 mg) von Fischöl zu lösen.
   3. (Dies dauert einige Sekunden) nach dem Lösen von Öl, übertragen die gesamte Lösung direkt in ein hochwertigen 5-mm-NMR-Röhrchen und eine Kappe befestigen. Analysieren Sie die Proben innerhalb von 24 Stunden nach der Herstellung der Proben.

2. NMR Instrumentenaufbereitung

Hinweis: Vorsicht, Vorsicht, dass das Vorhandensein von starken Magnetfelder, die durch NMR-Geräte produziert medizinische Geräte beeinflussen können und implAmeisen wie Schrittmacher und chirurgische Prothesen, sowie elektronische Elemente wie Kreditkarten, Uhren, etc. Zusätzliche Vorsicht ist erforderlich, wenn die Analyse nicht-Abschirm - Magneten durchgeführt wird. Zwei NMR Instrumente wurden für den Erwerb von ¹ H und ¹³ C - NMR - Spektren verwendet wird ; ein Spektrometer bei 850,23 MHz und 213,81 MHz für ¹ H und ¹³ C - Kern arbeiten, jeweils mit einer Dreifachresonanzheliumgekühlten inverser (TCI) 5 mm - Sonde und einem Spektrometer ausgestattet bei 500,20 MHz und 125,77 MHz für ¹ H und ¹³ C - Betrieb Kerne, die jeweils mit einem breiten Band ausgestattet beobachtet (BBO) 5 mm-Sonde Stickstoff gekühlt. Alle Experimente bei 25 ± 0,1 ° C durchgeführt wurden und die Spektren durch ein Standard-NMR-Datenanalyse Erfassung und Verarbeitung von Softwarepaket verarbeitet wurden (siehe Materialliste).

1. Vorbereitung für die NMR - Spektren Erwerb
   Anmerkung: ¹ H und ¹³ C NMR - Spektrenkann folglich erworben werden, ohne die Probe aus dem Gerät zu entfernen.
   1. Stecken Sie die NMR-Röhrchen in eine Schleuder Turbine (siehe Materialliste).
   2. Platzieren Sie den Spinner und das Rohr auf der Oberseite eines abgestuften Tiefenmaß und sanft drückt die Oberseite des Rohrs, bis sein Bodenteil den Boden des Sensors berührt.
   3. Legen NMR-Probe in einer offenen Stelle des SampleCase. Man beachte die Schlitznummer in der Probe angeordnet wird.
   4. Um die Probe in der NMR zu laden, kehren Sie zu dem Steuercomputer und geben Sie ‚sx #‘, wobei # der Schlitz in der SampleCase Halten Sie Ihre Probe ist.
   5. Warte auf das Deuterium - Signal von CDCl ₃ auf dem Sperrfenster - Bildschirm angezeigt. Wenn es nicht automatisch angezeigt wird, geben Sie „lockdisp“. Sobald das Deuteriumsignal sichtbar ist, Typ „sperrt“ auf der Befehlszeile und wählt „CDCl _3“ aus der Liste der Lösungsmittel, um die Probe unter Verwendung der _CDCI3 Deuterium Resonanz zu verriegeln.
      HINWEIS: Deuterium signal möglicherweise nicht angezeigt, wenn vorherige Benutzer ein anderes Lösungsmittel verwendet wird. Der Benutzer sollte für die Anzeige warten, dass die Probe nach unten ist, dann sperren.
   6. Type „bsmsdisp“ in der Befehlszeile Spinnen, um sicherzustellen, ist nicht aktiv. Wenn die Taste „Schleudern“ grün ist, klicken Sie Spinnen zu deaktivieren.
   7. Geben Sie den Befehl „Neu“ einen neuen Datensatz zu erstellen. Geben Sie einen Namen für die Daten, die im „NAME“ Tab und dem Experiment Nummer in der „EXPNO“ aus. Verwenden Nummer „1“ in der „PROCNO“ aus. Im „Experiment“ Registerkarte klicken Sie auf „Auswählen“ und wählen Sie die „PROTON“ Parameterdatei. Schreiben Sie den Titel des Experiments in der „TITLE“ aus. OK klicken."
   8. Geben Sie „getprosol“ in die Befehlszeile die Standard-Parameter für den aktuellen NMR-Sonde und Lösungsmittel zu erhalten.
   9. Wiederholen Sie Schritt 2.1.7 für ¹³ C, die "C13IG" Pulssequenz in dem "Experiment" Register für die ¹³ C 1D Auswählen inverse gated entkoppelt Experiment.
   10. Geben Sie „getprosol“ in die Befehlszeile die Standard-Parameter für den aktuellen NMR-Sonde und Lösungsmittel zu erhalten.
   11. Geben Sie den Befehl „Atma“, um die automatische Abstimmung und Anpassung der Sonde sowohl für Kohlenstoff und Protonenkerne zu führen.
   12. Durchführen einer eindimensionalen Gradienten ein hoch homogenes Magnetfeld zu erreichen Shimmen, und damit eine optimale Linienform für die NMR-Signale.
       1. Verwenden Sie den Standard-automatisches Verfahren für 1D- Shim, einfach durch sequentielles Ausführen der Befehle „qu topshim 1dfast ss“, „qu topshim tuneb ss“ und „qu topshim report“ in die Befehlszeile.
2. Parameteroptimierung
   1. 90 ° -Impuls Kalibrierungs
      1. Erstellen einen neuen Datensatz für ¹ H (siehe Schritte 2.1.7 und 2.1.8).
      2. Geben Sie den Befehl „paropt“ in der Befehlszeile für die Kalibrierung des 90 ° pul das Automatisierungsprogramm zu startense. Wählen Pulsdauer, p1, als Parameter geändert werden.
      3. Beginnen mit „2“ & mgr; s als den Anfangswert von P1, geben Sie „2“ & mgr; s-Schritte und durchzuführen, „16“ Experimente.
      4. Erstellen einen neuen Datensatz für C ¹³ (siehe Schritt 2.1.9) und wiederholt den Vorgang für ¹³ C - Kern (siehe Schritte 2.2.1.2 und 2.2.1.3).
   2. T ₁ Messung durch die Nullmethode gemessen ¹⁶ für ¹ H
      HINWEIS: Die Null - Methode verwendet die Inversion - Recovery - Pulssequenz, bestehend aus einem 180 ° -Impuls durch eine Folgeverzögerung (tau), Entspannung entlang der Z - Achse zu ermöglichen , und einem letzten 90 ° Impuls, der die beobachtbare transversale Magnetisierung erzeugt.
      1. Erstellen einen neuen Datensatz für ¹ H (siehe Schritte 2.1.7 und 2.1.8).
      2. Geben Sie „pulprog t1ir1d“, um die Impulsfolge zu dem Experiment Inversion-Recovery zu ändern.
      3. Geben Sie die folgenden Befehle auf dem commanD-Linie, um die spektrale Breite in ppm, in der Mitte des HF-Senders auf, die Anzahl von Abtastungen der Anzahl des Dummy-Scans und die Anzahl der Datenpunkte „SW 8“, „O1P 3.8“, „ns 2“, „ds 2" und "td 64K".
      4. Type „p1 (Wert)“ und gibt die Werte für die Dauer 90 ° Impuls, wie durch die Impuls Kalibrierung bestimmt (siehe Schritt 2.2.1) und Typ „p2 (Wert)“ für das 180 ° -Impuls (den Dauerwert für den 180 & deg; Impuls ist die Impulsdauer 90 ° mit zwei multipliziert).
      5. Stellen Sie die Recycling-Verzögerung auf einen sehr großen Wert, wie 10 s durch Eingabe von „d1 10“.
      6. Set tau auf einen kurzen Wert, wie 10 ms, durch „d7 10ms“ in der Befehlszeile eingeben.
      7. Stellen Sie die Empfängerverstärkung (RG) auf einen geeigneten Wert den Befehl „RGA“ für die automatische Berechnung von RG verwenden.
      8. Führen Sie ein Spektrum durch den Befehl „zg“ eingeben.
      9. Führen Sie Fourier-Transformation durch Eingabe von "EFP"in der Befehlszeile.
      10. Führen Sie die automatische Phasenkorrektur durch den Befehl „apk“ in der Befehlszeile eingeben. Wenn zusätzliche Phasen Anpassungen erforderlich sind, um weiter das Spektrum zu verbessern, klicken Sie auf den „Process Registerkarte“ dann klicken Sie auf die „Phase Adjust“ Symbol, um den Phasenkorrekturmodus.
          1. Verwenden nullter Ordnung (0) und erste Ordnung (1) Phasenkorrektur-Symbole durch Ziehen der Maus, bis alle Signale in negativem Absorptionsmodus befinden. Übernehmen und die Phasenkorrekturwerte speichern, indem Sie den „Return und Speichern“ -Buttons des Phasenkorrekturmodus zu verlassen.
      11. Erhöhen Sie den Tau , bis alle Peaks entweder positiv oder auf Null gesetzt sind durch Wiederholen der Schritte 2.2.2.6-2.2.2.9. Um den T ₁ - Wert zu bestimmen, teilen Sie einfach den Tau - Wert , bei dem die Spitze mit LN2 auf Null gesetzt wird.
   3. T ₁ Messung durch die Nullmethode gemessen ¹⁶ für C ¹³
      1. Erstellen eines neuen Datensatzes für C ¹³ (siehe Schritt 2.1.9)
      2. Type „pulprog t1irpg“, um die Impulsfolge an das für Kohlenstoffkerne Inversion-Recovery-Experiment zu verändern.
      3. Die folgenden Befehle in der Befehlszeile, die spektrale Breite in ppm einzurichten, in der Mitte des HF-Senders, um die Anzahl der Abtastungen, die Anzahl der Dummy-Scans und die Anzahl von Datenpunkten: „SW 200“, „O1P 98“ "ns 8", "ds 2" und "td 64K".
      4. Type „p1 (Wert)“ und gibt die Werte für die Dauer 90 ° Impuls, wie durch die Impuls Kalibrierung bestimmt (siehe Schritt 2.2.1) und Typen „p2 (Wert)“ für das 180 ° -Impuls (der Zeitdauerwert ist 90 ° Impulsdauer mit zwei multipliziert).
      5. Stellen Sie die Recycling-Verzögerung auf einen sehr großen Wert, wie 100 s durch Eingabe von „d1 100“.
      6. Set Tau auf einen kurzen Wert, wie zum Beispiel 100 ms von „d7 100ms“ in der Befehlszeile eingeben.
      7. Stellen Sie den Fordeer Verstärkung (RG) auf einen geeigneten Wert den Befehl „RGA“ für die automatische Berechnung von RG verwenden.
      8. Führen Sie ein Spektrum durch den Befehl „zg“ eingeben.
      9. Führen Sie Fourier-Transformation durch „EFP“ in der Befehlszeile eingeben.
      10. Führen Sie automatische Phasenkorrektur durch den Befehl „apk“ in der Befehlszeile eingeben. Wenn zusätzliche Phasen Anpassungen erforderlich sind, um weiter das Spektrum zu verbessern, klicken Sie auf den „Adjust Phase“ Symbol und die Phasenkorrektur Symbole für Ordnung Null (0) und Phase erster Ordnung (1) Korrektur.
          1. Während auf den Null-Ordnung und erster Ordnung Phasenkorrektur Symbole klicken, ziehen Sie die Maus, bis alle Signale in negativer Absorptionsmodus sind. Übernehmen und die Phasenkorrekturwerte speichern, indem Sie den „Return und Speichern“ -Buttons des Phasenkorrekturmodus zu verlassen.
      11. Erhöhen Sie den Tau , bis alle Peaks entweder positiv oder auf Null gesetzt sind durch Wiederholen der Schritte 2.2.3.6-2.2.3.9. Bestimmendie T & _sub1 ; -Wert, teilen einfach den Tau - Wert , wo die Spitze mit LN2 genullt wird.
3. Eindimensionale (1D) NMR Spectra
   1. ¹ H-NMR - Spektren
      1. Akquisition der NMR - Daten
         1. Geh zu dem ¹ H - Datensatz in Schritt erstellten 2.1.7 und verwenden die Standard „pulse-acquire“ Impulsfolge „zg“ von „pulprog zg“ in der Befehlszeile eingeben.
         2. Die folgenden Befehle in der Befehlszeile, die spektrale Breite in ppm einzurichten, in der Mitte des HF-Senders, um die Anzahl der Abtastungen, die Anzahl der Dummy-Scans, um die Anzahl von Datenpunkten, und die Impulsdauer für einen 90 ° -Impuls Winkel : "SW - 8", "O1P 3.8", "ns 2", "ds 2", "td 64K" und "p1 (wie durch Impuls Kalibrierung bestimmt)" (siehe Schritt 2.2.1).
            HINWEIS: 32K Datenpunkte können für das 500-MHz-Instrument verwendet werden.
         3. Stellen Sie einen Relaxationsverzögerung von 7 s für das 500 MHz-Instrument oder 9 s für das 850 MHz-Instrument mit "d1 7S" oder "d1 9s" ist, in der Befehlszeile eingeben.
         4. Stellen Sie die Empfängerverstärkung (RG) auf einen geeigneten Wert den Befehl „RGA“ für die automatische Berechnung von RG verwenden.
         5. Geben Sie „digmod baseopt“, um ein Spektrum mit einem verbesserten Ausgangswert zu erwerben.
         6. Starten Sie die Aufnahme, indem Sie die Impuls-acquire Befehl „zg“ in der Befehlszeile.
      2. Verarbeitung der NMR - Daten
         1. Geben Sie „si 64K“ in der Befehlszeile Null-Füllung anzuwenden und die Größe des realen Spektrums auf 64 KB gesetzt.
         2. Stellen Sie den Zeilenparameter auf 0,3 Hz Verbreiterung von „0,3 lb“ in der Befehlszeile eingeben eine Gewichtungsfunktion (exponentieller Abfall) mit einem Linienverbreiterungsfaktor von 0,3 Hz vor der Fourier-Transformation anzuwenden.
         3. Führen Sie Fourier-Transformation durch „EFP“ in dem Befehl eingebenLinie.
         4. Führen Sie automatische Phasenkorrektur durch den Befehl „apk“ in der Befehlszeile eingeben. Wenn zusätzliche Phasen Anpassungen erforderlich sind, um weiter das Spektrum zu verbessern, klicken Sie auf den „Process Registerkarte“ dann klicken Sie auf die „Phase Adjust“ Symbol und die Phasenkorrektur Symbole für Ordnung Null (0) und erster Ordnung (1) Phasenkorrektur .
            1. Während auf den Null-Ordnung und erster Ordnung Phasenkorrektur Symbole klicken, ziehen Sie die Maus, bis alle Signale in positive Absorptionsmodus sind. Übernehmen und die Phasenkorrekturwerte speichern, indem Sie den „Return und Speichern“ -Buttons des Phasenkorrekturmodus zu verlassen.
         5. Tragen Sie eine Polynom-Funktion vierter Ordnung für Basislinienkorrektur bei der Integration durch den Befehl „abs n“ eingeben.
            HINWEIS: Dies sorgt für eine flache spektrale Basislinie mit einer minimalen Intensität.
         6. Bericht chemische Verschiebungen in ppm von TMS (δ = 0). Klicken Sie auf die Kalibrierung ( "Calib. Ax"Symbol) und setzen Sie den Cursor mit der roten Linie auf der Oberseite des TMS-NMR-Signals (Peak am nächsten 0) gewonnen. Linksklick und geben Sie‚0‘.
      3. NMR Datenanalyse
         1. Integrieren Spektralbereich von δ 1,1 0,6 bis & delta; sowie die Peaks bei δ 4,98, δ 5,05 und δ 5,81 unter Verwendung des „Integrate“ -Symbol (unter dem „Process“ TAB) und die Beleuchtung ( „Define neue Region“) -Symbol. Linksklick und ziehen durch die Integrale.
            HINWEIS: Wenn es auf eine Region konzentrieren müssen, klicken Sie auf das Symbol markieren mit der Maus auf die Region vergrößern deaktivieren und klicken Sie links und ziehen. Zum Einstellen Taste, um die Schwellenintensität, verwenden Sie die mittlere Maus, wenn nötig. Klicken Sie auf das Highlight Symbol wieder die Integrationsfunktion zu aktivieren, dann zum nächsten Gipfel bewegen.
            1. Normalisieren die Summe der obigen Integrale bis 100 mit einem rechten Mausklick auf dem Integralwert, die angezeigt werdens unter dem Signal und wählen Sie „Normalisieren Summe von Integralen“. Geben Sie den Wert „100“ in das Feld ein und klicken Sie auf den „Return und Speichern“, um den Integrationsmodus zu verlassen.
         2. Wenn BHT als interner Standard verwendet wird , die Integration der Peaks bei δ 6,98 und stellen das Integral gleich den Millimol BHT pro 0,5 ml der Vorratslösung.
         3. Integrieren der Peaks von Interesse (siehe Schritt 2.3.1.3.1), die sich von 10 Hz von jeder Seite des Peaks, wenn möglich.
         4. Verfahren ¹³ C-NMR - Spektren Erfassung und Verarbeitung auf ähnliche Weise durchzuführen.
   2. ¹³ C-NMR - Spektren
      1. Akquisition der NMR - Daten
         1. Gehe zu der ¹³ C - Datensatz und verwenden , um die inverse gated entkoppelten Impulsfolge „zgig“ durch Eingabe von „pulprog zgig“ in die Befehlszeile.
            HINWEIS: Um ein Kohlenstoff-Experiment mit dem Standard-Breitband Decou läuftPLED-Pulssequenz, Typ „pulprog zgpg“ in die Befehlszeile.
         2. Die folgenden Befehle in der Befehlszeile, die spektrale Breite in ppm einzurichten, in der Mitte des HF-Senders, um die Anzahl der Abtastungen, die Anzahl der Dummy-Scans, um die Anzahl von Datenpunkten, und die Impulsdauer für einen 90 ° -Impuls Winkel : "SW-200", "O1P 95", "16 ns", "ds 2", "td 64K" und "p1" (wie durch Puls Kalibrierung bestimmt) (siehe Schritt 2.2.1.4).
         3. Stellen Sie einen Relaxationsverzögerung von 35 s für das 500-MHz-Instrument oder 45 s für das 850 MHz-Instrument mit "d1 35s" oder "45s d1", bzw. in der Befehlszeile eingeben. Wenn BHT verwendet wird, sollte Relaxationsverzögerung 50 s in dem 500 MHz-Gerät und 60 s in dem 850 MHz-Gerät.
         4. Stellen Sie die Empfängerverstärkung (RG) auf einen geeigneten Wert den Befehl „RGA“ für die automatische Berechnung von RG verwenden.
         5. Geben Sie „digmod baseopt“ in der Befehlszeile ein Spektrum zu erwerben with verbesserte Basislinie.
         6. Starten Sie die Aufnahme, indem Sie die Impuls-acquire Befehl „zg“ in der Befehlszeile.
      2. Verarbeitung der NMR - Daten
         1. Geben Sie „si 64K“ in der Befehlszeile Null-Füllung anzuwenden und die Größe des realen Spektrums auf 64 KB gesetzt.
         2. Stellen Sie den Zeilenparameter auf 1,0 Hz Verbreiterung durch „lb 1.0“ in der Befehlszeile eingeben eine Gewichtungsfunktion (exponentieller Abfall) mit einem Linienverbreiterungsfaktor von 1,0 Hz vor der Fourier-Transformation anzuwenden.
         3. Führen Sie Fourier-Transformation durch „EFP“ in der Befehlszeile eingeben.
         4. Führen Sie automatische Phasenkorrektur durch den Befehl „apk“ in der Befehlszeile eingeben. Wenn zusätzliche Phasen Anpassungen erforderlich sind, um weiter das Spektrum zu verbessern, klicken Sie auf den „Process Registerkarte“ dann klicken Sie auf die „Phase Adjust“ Symbol und die Phasenkorrektur Symbole für Ordnung Null (0) und Phase erster Ordnung (1) Korrektur .
            1. Während auf der nullten Ordnung und erster Ordnung Phasenkorrektur Symbole klicken, ziehen Sie die Maus, bis alle Signale in positive Absorptionsmodus sind. Übernehmen und die Phasenkorrekturwerte speichern, indem Sie den „Return und Speichern“ -Buttons des Phasenkorrekturmodus zu verlassen.
               HINWEIS: Für Kohlenstoffspektren auf Larmorfrequenz von 214 MHz (850 MHz-Gerät) die Korrektur der frequenzabhängigen Fehler (erster Ordnung) aufgezeichnet ist, kann schwierig und zeit für weniger erfahrene Anwender aufwendig sein wegen der großen Off-Resonanz-Effekte von der 90 ° Puls.
         5. Tragen Sie eine Polynom vierter Ordnung Funktion für Basislinienkorrektur bei der Integration durch den Befehl „abs n“ in der Befehlszeile eingeben.
         6. Bericht chemische Verschiebungen in ppm von TMS (δ = 0). Klicken Sie auf der Kalibrierung ( „Calib. Achse“) Symbol und setzen Sie den Cursor mit der roten Linie auf dem NMR-Signal zu referenzieren. Linksklick und geben Sie in „0“.
      3. NMR Datenanalyse
         1. Integrieren Sie die spektralen Bereich von δ 175 171 bis & dgr; mit der „Integration“ -Symbol (unter dem Register „Entwickeln“) und das Highlight ( „Define neue Region“) Symbol. Linksklick und ziehen durch die Integrale.
            HINWEIS: Wenn es auf eine Region konzentrieren müssen, klicken Sie auf das Symbol markieren mit der Maus auf die Region vergrößern deaktivieren und klicken Sie links und ziehen. Klicken Sie auf das Highlight Symbol wieder die Integrationsfunktion zu aktivieren, dann zum nächsten Gipfel bewegen.
            1. Stellen Sie das Integral auf 100 durch einen Rechtsklick auf den Integralwert zu tun, die unter dem Signal erscheint, und wählen Sie „Kalibrieren Current Integral“. Geben Sie den Wert „100“ in das Feld ein und klicken Sie auf den „Return und speichern“, um den Integrationsmodus zu verlassen.
         2. Wenn BHT als interner Standard verwendet wird , die Integration der Peaks bei δ 151,45 und stellen das Integral gleichdie Millimol BHT pro 0,5 ml der Stammlösung.
         3. Integrieren den Peaks von Interesse erstreckt 5 Hz von jeder Seite des Peaks (siehe Schritt 2.3.2.3.1).

¹ H und ¹³ C NMR - Spektren wurden für im Handel erhältlichen Fischtranergänzungen NMR unter Verwendung von zwei Instrumenten gesammelt; ein 850 MHz und einem 500 MHz-Spektrometer. Diese Spektren können zur quantitativen Bestimmung von Bestandteilen von Fischöl, wie Docosahexaensäure (DHA) und Eicosapentaensäure (EPA), als auch andere Verbindungen, wie n - 1 Acylketten und ernährungsphysiologisch wichtigen Index, wie die n verwendet werden -6 / n - 3 - Verhältnis. Die Quantifizierung kann ohne die Verwendung eines internen Standards, auch durchgeführt werden, jedoch müssen die quantitativen Ergebnisse als relative Molprozente ausgedrückt werden. Wenn die Daten müssen in absoluten Werten ausgedrückt werden (mg / g), wird ein interner Standard erforderlich. Die Ergebnisse , erhielten durch NMR sind in hohem Maße reproduzierbar mit relativen Standardabweichungen (RSD) im Bereich von 0,3% bis 2% für die ¹³ C - NMR - Analyse und von 0,5% bis 2,5% für die ¹ H - NMR - Analyse in Abhängigkeit von t er Lipids. Der etwas höhere RSD für ¹ H - NMR wird häufig beobachtet , da Protonenspektren sind in der Regel überfüllt werden, was die Genauigkeit der Analyse beeinflußt, insbesondere für Resonanzen , die ein niedrigeres Signal - zu - Rausch - Verhältnis (S / N) haben. Eine sehr gute Übereinstimmung zwischen dem 850 MHz und 500 MHz-Instrumente mit RSD im Bereich von 1% bis 4% gefunden. Relativ hohe RSDs (bis zu 8%) beobachtet wurden , wenn die Ergebnisse , erhalten durch ¹ H und ¹³ C, insbesondere für die Verbindungen , die in niedrigen Konzentrationen auftreten, wie n -1 Acylketten vergleicht. NMR-Spektroskopie wurde als Werkzeug für die Lipidanalyse, einschließlich der Bestimmung von einigen Fischölkomponenten zuvor validiert. Die Ergebnisse zeigten , dass es mit herkömmlichen Methoden wie GC ^{17, 18} in guter Übereinstimmung.

¹ H - NMR - Analyse

"xfig"> Abbildung 1 vergleicht die ¹ H NMR Spektren werden auf (A) erworben ein 850 MHz und (B) ein 500 MHz - Instrument. Das 850 MHz - Spektrum wird durch eine höhere Auflösung aus, jedoch ist die Hauptkomponenten von Fischöl einschließlich DHA, EPA, und n 6 / n - 3 - Verhältnis kann auch aus dem 500 MHz - Spektrum bestimmt werden. Die ¹ H-NMR - Signale von Fischöl - Fettsäuren , die für die Quantifizierung Zwecke verwendet werden können , sind in Tabelle 1, während die komplette NMR Zuordnung des ¹ H - NMR - Spektrums von Fischöl gezeigt , an anderer Stelle ¹⁹ gefunden werden kann.

¹ H - NMR ergab zuverlässige Daten zur Quantifizierung der Gesamtmenge an n - 3, n -6, DHA, trans - Fettsäuren, n -1 Acylketten, und gesättigte Fettsäuren (SFA). Für die ¹ H - NMR - Analyse, ist die Verwendung von entsprechenden Beziehungen erforderlich , da die meisten der signals gehören zu Gruppen von Protonen, die an verschiedenen Fettsäuren und Lipiden üblich sind. Aus diesem Grunde wird in den meisten Fällen die Konzentration der Fettsäuren in Fischöl kann nur durch Kombination von verschiedenen ¹ H - NMR - Signalen, eingearbeitet in den entsprechenden Beziehungen bestimmt werden. Zusätzlich enthalten diese Gleichungen arithmetische Koeffizienten, die die unterschiedliche Anzahl der Protonen, die mit jeder Gruppe normalisieren. Wenn ein interner Standard wird die folgende Gleichung verwendet wird , sollte in Betracht gezogen werden: C = I / _IS I × n / N × A × MW / m (1), wobei C die Konzentration des Analyten in mg / g Fischöl ist, I das Integral einer Resonanz , die eindeutig den Lipid von Interesse zurückzuführen ist, i der Bereich eines Protonensignals ist , die eindeutig zu dem internen Standard gehört, N die Anzahl der Protonen der funktionellen Gruppe ist , die analysiert wird,N _ist die Anzahl der Protonen des internen Standards ist , die für die Analyse verwendet werden, wird ein die Millimol internen Standards ist, MW das Molekulargewicht der Fettsäure (in Methylester ausgedrückt wird ), und m ist die Menge an Fischöl in g ausgedrückt.

Beispiel 1 DHA: Der Anteil an DHA wird durch die Gleichung C _DHA = ¾ I _DHA / S bestimmt, wobei I _DHA ist das Integral des Signals bei δ 2,39 , die mit dem H _α und H _β - Protonen von DHA gehört und S ist die Summe der Integrale der Methylprotonen von SFA, n -6, -9 n, n - 3, trans - Fettsäuren sowie die Integrale der Peaks von n -1 Acylketten bei δ 4,98, δ 5,05 und δ 5,81. Das Integral I _DHA ist normalized durch Multiplikation von 3/4 , weil es vier Protonen entspricht, während das Integral S zu drei Protonen entspricht. ¹ H NMR ist nicht fähig , Informationen über Positionsverteilung von Fettsäuren auf dem Glycerin - Rückgrat zu geben und somit nur für die Quantifizierung der Gesamtmenge der Fettsäuren verwendet werden. Die ¹ H - NMR - Analyse einer eingekapselten Fischtranergänzung zeigte , dass es 10,5% DHA besteht. Die Konzentration von DHA in der gleichen Probe unter Verwendung von BHT wurde gefunden 105,23 mg / g zu sein. Diese Werte liegen sehr nahe an den Werten , die mit ¹³ C - NMR (siehe Beispiel 2 für ¹³ C - Analyse).

Beispiel 2 n -1 Acylketten: Die Konzentration von n - 1 Acylketten ist durch die Beziehung C _n-1 = 3 gegeben I _n-1 / S, wobei I _n-1 ist das Integral des Signals bei δ 5,818. DiesSignal entspricht einem Proton und benötigt somit durch Multiplikation mit drei normiert werden. Wenn BHT, n -1 Acylketten ist durch die Gleichung C _n-1 = 2 I _n-1 / I _BHT bestimmt. Die Ergebnisse können nicht in mg / g ausgedrückt werden , da die MW n -1 Acylketten ist unbekannt.

Beispiel 3, n ~ 6 / n - 3 - Verhältnis: Dieser wichtige Index kann aus dem Verhältnis der normierten Intensitäten der Resonanz bei δ 2,77 berechnet werden, die die bis-allylischen Protonen von n entspricht -6 Acylketten (zwei Protonen) Triplett bei δ 0,97 über das gehört n -3 - Fettsäuren und entspricht drei Protonen. Die Beziehung ist C _n-6 / _n-3 - C = 3/2 I _A / I _B, wo I _A und I _B die Integrale der Signalebei δ 2,77 und δ 0,97, respectively. n -6 Fettsäuren werden aus der Beziehung C _n-6 bestimmt = 3 / 2I _n-6 / S, wobei I _n-6 bei δ 2,77 Integral der bis-allylische Protonen ist.

Beispiel 4 trans - Fettsäuren: Trans - Fettsäuren können aus der Gleichung C = _trans I _trans / S berechnet werden, wobei I _trans ist das Integral des Signals bei 0,91 δ. Die vorliegende Probe enthielt 3,07% trans - Fettsäuren, wie bestimmt durch ¹ H NMR 850 MHz unter Verwendung des Instruments. Die gleiche Probe wurde in einem 500 MHz - Instrumente analysiert gefunden 3,03% trans - Fettsäuren enthalten.

Beispiel 5, gesättigte Fettsäuren (SFA): Die Konzentration der SFA calcul sein kannaufgeblasen aus der Gleichung S = C _SFA - C _n-3 - C _n-6 - C _n-9 - C _n-1 - C _trans. n -9 Fettsäuren (hauptsächlich Ölsäure) kann nach der Gleichung C quantifizierenden _n-9 = (3/4 Q - 3/2 I _n-6) / S, wobei Q das Integral der allylischen Protonen von n -6 und -9 n bei 2,01 δ. Die Menge der SFA in einem handelsüblichen Fischölprobe wurde gefunden 36,1% liegt. Die gleiche Probe mit ¹³ C - NMR analysiert wurde , enthielt 33,8% SFA gefunden. SFA stellt eine Gruppe von verschiedenem FA (zB Stearin- und Palmitinsäure) mit unterschiedlichen MW und damit ihre Konzentration , wenn Fischöl nicht in mg / g ausgedrückt werden.

Beispiel 6 Gesamtsterine: Die Menge der gesamten Sterole (freie und veresterte) durch die sig bestimmt werdennal der Methylprotonen am Kohlenstoff 18 , die bei δ 0,68, unter Verwendung der Gleichung C = I erscheint _ste / S. Das Molverhältnis der Gesamtsterine in einer im Handel erhältlichen Fischölprobe wurde gefunden 0,32% liegt. BHT kann auch zur Bestimmung der absoluten Konzentration von Sterolen verwendet werden. Die wichtigsten Sterine in Fischöl sind Cholesterin und Vitamin D (oder deren Vorstufe 7-Dehydrocholesterol) und sind in den Ergänzungen oft hinzugefügt. Diese Verbindungen haben eine sehr ähnliche MW. Daher können die Ergebnisse in mg / g ausgedrückt werden , und werden nach der folgenden Gleichung berechnet C = 2/3 I _STE / I _ist ein _STE × MW / m, wobei MW _STE die Molekülmasse ist (386) des Cholesterins, das die ausmacht Mehrheit der sterolic Fraktion in Fischöl ^20. Die Menge an Sterolen in derselben Probe unter Verwendung von BHT betrug 3,8 mg / g Fischöl. Die individuelle Bestimmung von Cholesterin (δ 0.680) und 7-Dehydrocholesterol (δ 0,678) durchführbar ist auf einem 850 MHz - Instrument nach der Anwendung einer Fensterfunktion für Auflösungsverbesserung.

¹³ C - NMR - Analyse

Figur 2 zeigt die ¹³ C - NMR - Spektren erfaßt auf (A) ein 850 MHz und (B) ein 500 MHz - Instrument in dem Carbonylkohlenstoff Bereich. Die beiden Spektren sehr ähnlich sind und die gleiche Menge an Informationen zur Verfügung stellen kann. Das ¹³ C - NMR - Spektrum kann erfolgreich für die Analyse von zusätzlichen Fettsäuren wie Stearidonsäure (SDA) und Eicosatetraensäure (ETA) Säuren verwendet werden, aber mehr Scans für die Proben erforderlich , in denen diese Säuren in niedrigeren Konzentrationen sind. Die ¹³ C - Spektren sind durch hohe Auflösung aufgrund der großen spektralen Breite und die Anwendung von Breitband - Entkopplung, diebeseitigt die Wirkung der skalaren Kopplung und erzeugt Singuletts. Aus diesem Grunde ist es auch begrenzt überlappende, wenn ein 500-MHz-Instrument.

Das ¹³ C - NMR - Spektrum ist viel informativer im Vergleich zu dem ¹ H NMR - Spektrum und kann umfassen quantitative Daten liefern , weil weniger Signalüberlappungs beobachtet werden (Abbildungen 1 und 2). Die nützlichste Spektralbereich des ¹³ C - Spektrums ist der Carbonyl - Kohlenstoffbereich , weil es für eine große Anzahl von Fettsäuren sowie für ihre Positionsverteilung auf dem Glyceringrundgerüst ^{19, 21, 22} quantitative Informationen liefert. Die Methylgruppe Bereich von 13,5 bis 14,5 δ & dgr; kann für die schnelle Bestimmung der Gesamtmenge an n - 3, n -6, -9 n und gesättigte Fettsäuren verwendet werden ,Säuren (SFA) sowie trans - Fettsäuren. Jedoch wird in dem 500 - MHz - NMR - Spektrometer, gibt es eine teilweise Überlappung der n -6 und -9 n gesättigte Fettsäuren (SFA). Die Anwendung einer Fensterfunktion für Auflösungsverbesserung kann dieses Problem lösen, obwohl das 850 MHz-Instrument noch eine zuverlässigere Option in Betracht gezogen wird. Der olefinische Bereich des Kohlenstoffspektrums kann für die Gesamtmenge von n verwendet werden , -3 und -1 n Acylketten sowie zur Bestimmung der einzelnen Fettsäuren wie DHA, EPA, Arachidonsäure (AA), Linolen- (Ln) n -3 und Ölsäure (OL) (siehe Tabelle 2). ¹³ C - NMR kann auch für die Charakterisierung von Fischöl aus anderen Quellen, wie beispielsweise Nahrungsergänzungsmittel reich an Ethylestern (EE) unter Verwendung der Kohlenstoff - Signale bei δ 14,31 (Methyl) und δ 60,20 (Methylen) angewendet werden.

Für Kohlenstoffanalyse können Fettsäuren determ seinined durch das Integral der entsprechenden aliphatischen, olefinischen Dividieren und Carbonyl - Signale mit dem Gesamtintegral aller Acylketten, gemäß der allgemeinen Beziehung C = I / S (2), wobei C die Konzentration des Analyten in Mol (% ), ist I das Integral einer Resonanz , die eindeutig dem Lipid von Interesse zugeschrieben wird, und S die Gesamtintegral des Signals (S), der den Gesamtlipidgehalt der Probe darstellt. Das Gesamtintegral S von Acylketten kann durch Integration der Region von δ 175 bestimmt werden , 171 bis & dgr; und ist auf 100.

Quantifizierung von Fettsäuren in mg / g Fischöl wird unter Verwendung eines internen Standard auf der Basis der folgenden Beziehung durchgeführt wird : C = I / I _bin × A × MW / m (3), wobei C die Konzentration des Analyten ist in mg / gFischöl ist I das Integral einer Resonanz , die eindeutig dem Lipid von Interesse zurückzuführen ist, I die Fläche eines Kohlenstoff - Signal ist , die eindeutig zu dem internen Standard gehört, A die Millimole des internen Standards ist, MW das Molekular Gewicht der Verbindung von Interesse (für Fettmethylestern in ausgedrückt Säuren), und m ist die Menge an Fischöl in g. Die ¹³ C-NMR - Signale von Fischöl - Fettsäuren , die für die Quantifizierung Zwecke verwendet werden können , sind in Tabelle 2, während die vollständige NMR Zuordnung des ¹³ C - NMR - Spektrums kann an anderer Stelle gezeigt , ¹⁹ gefunden werden.

Beispiel 1, EPA in sn - 2 - Position: Die Menge (%) von EPA auf der sn - 2 - Position wird berechnet, indem das Integral des Signals berechnet bei δ 172,56 S durch. Die Menge an EPA in der sn - 2 - Position in einem commercially wurde Probe vorhanden sein, 3,4% mit dem 850 MHz-Gerät gefunden. Unter Verwendung desselben Spektrometers und BHT als interner Standard, ist die Menge von EPA in der Position sn - 2 , ausgedrückt in mg / g Fischöl ist 29,73 mg / g. Die gleiche Probe wurde in einem 500 MHz - Instrumente analysiert gefunden 3,6% oder 31,39 mg / g EPA in der sn - 2 - Position enthält. Ähnliche Ergebnisse können erhalten werden , wenn die relativen Moleküle Verhältnisse von EPA bei der Berechnung sn -2 ein voll entkoppelte Spektrum. Dies liegt daran, dass das Carbonylkohlenstoffatom von EPA durch Protonenentkopplung auf demselben vernachlässigbaren Ausmaß wie die anderen Carbonylkohlenstoffatome beeinflußt wird, die als Referenz verwendet werden. Es werden jedoch große Abweichungen beobachtet , wenn BHT verwendet wird , weil der Kohlenstoff von BHT bei δ 151.45, die für die Quantifizierung verwendet wird, eine andere NOE - Verstärkung erhält im Vergleich zu den Carbonylkohlenstoffatome von Fettsäuren. Aus diesem Grunde sollte das vollständig entkoppelten Spektrum vermieden werden, wenn interne Standards oder c Integrationarbons mit verschiedenen Multiplizitäten.

Beispiel 2 Gesamtmenge der DHA: Die Gesamtmenge (%) von DHA wird einfach durch Hinzufügen der Mengen an DHA in sn -1,3 und sn - 2 - Position berechnet , wie bei δ 172,48 durch die NMR - Signale ermittelt und δ 172,08, respectively. Die gleiche Probe , die analysiert und mit ¹ H - NMR (siehe Beispiel 1 von ¹ H - Analyse) wurde nach ¹³ C - NMR - Analyse enthielt 10,3% DHA gefunden. Die Menge an DHA kann auch unter Verwendung eines internen Standards und Gleichung 3. Die Gesamtmenge der DHA betrug 103,25 mg / g in mg / g ausgedrückt werden.

Beispiel 3 Gesamtmenge der SDA: Die Gesamtmenge (%) der SDA wird durch Hinzufügen der Integrale der Signale bei δ 172,99 und 172,60 δ die sn -1,3 die Carbonylkohlenstoffatome von SDA auf Position gehörend bestimmt undsn - 2, bzw. dann Dividieren der Summe durch S. Die zu analysierende Probe wurde gefunden 3,93% SDA oder 34,54 mg / g enthalten.

Beispiel 4 N - 3 Ln: n -3 Ln (%) kann durch Dividieren des Integrals des Signals bei δ 131,85 mit dem Integral S bestimmt werden. Das molare Verhältnis von n - 3 Ln in der analysierten Probe Fischöl betrug 0,7%. Die absolute Konzentration BHT verwendet wurde als 5,5 mg / g berechnet.

Beispiel 5 trans - Fettsäuren: Das molare Verhältnis von trans - Fettsäuren wird durch Dividieren des Integrals des Signals bei δ 13.80 mit S bestimmt. Die Analyse der gleichen Probe , die mit ¹ H NMR analysiert und es wurde gefunden 3,07% trans FA zu sein, wurde auch mit ¹³ C - NMR und dessen trans - Fettsäure-Gehalt 3,42% gefunden analysiert. Ter ¹³ C - NMR - Analyse der gleichen Probe auf einem 500 MHz - Gerät zeigte ein 3,64% Gehalt an trans - Fettsäuren. Die Menge an trans FA in mmol / g Fischöl kann als interner Standard und die Gleichung C unter Verwendung von BHT bestimmen = I / I _ist × A / m, aber Ergebnisse können nicht bei δ 13.80 , da der Spitzenwert in mg / g ausgedrückt werden , entspricht verschiedene trans - Fettsäuren, hauptsächlich trans DHA und EPA trans, mit verschiedenen MW.

Beispiel 6, EE: Die Konzentration von EE in einer Fischölprobe wird durch Dividieren des Integrals der spektralen Bereich berechnet aus δ 60.50 60.00 bis & Delta; S , die mit an die Methylenkohlenstoffen der EE verschiedener Fettsäuren, entspricht. Die Analyse einer EE Fischölprobe zeigte, dass es aus 100% EE bestand. Es sollte beachtet werden, dass in EE Proben, EPA can entweder bei δ 173,60 oder durch die Methyle EE Kohlenstoff durch die Carbonyl - Peaks berechnet wird bei δ 60,20, während DHA berechnet werden kann unter Verwendung von an das Signal δ 60,31 und / oder das Signal bei δ 173,09.

Eine vollständige Liste der Diagnosesignale , die zur Quantifizierung Zwecke mit ¹³ C und ¹ H - NMR - Analyse verwendet werden können , können in den Tabellen 1 bzw. 2 zu finden, während eine detaillierte Beschreibung der Gleichungen , die für diese Analyse verwendet werden können , können gefunden werden , an anderer Stelle ^19.

NMR kann zusätzlich für die Beurteilung des Oxidationszustandes von Fischölergänzungen angewandt werden. Figur 3 vergleicht die ¹ H - NMR - Spektren einer Fischölprobe unter zwei Oxidationsbedingungen; Exposition gegenüber Erhitzen und Bestrahlung mit ultraviolettem (UV)Licht. Lipid-Oxidation ist ein komplizierter Prozess, und die Zusammensetzung der Oxidationsprodukte hängt von den Bedingungen der Oxidation. Die wichtigsten sind Oxidationsprodukte Hydroperoxide (δ 8,0-8,8), konjugierte Diene Hydroperoxide (δ 5,4-6,7) und Aldehyde (δ 9.0- 10).

Abbildung 1. Die ¹ H - NMR - Analyse. 850,23 (A) und 500,20 MHz (B) ¹ H-NMR - Spektrum einer Fischölergänzung in CDCl ₃ -Lösung. Die NMR-Signale von EPA und DHA, die für ihre Bestimmung verwendet werden können, sind gezeigt. Der Peak bei δ 0,97 kann für die Bestimmung der Gesamtmenge an n - 3 - Fettsäuren verwendet werden. Die Einhüllende bei δ von 1,39 bis 1,20 ist , abgeschnitten, wie es zu den Methylenprotonen aller Fettkette gehörts und kann nicht für Identifizierung oder Quantifizierung Zwecke verwendet werden. Das ¹ H - NMR - Spektrum wird durch eine schmalere spektrale Breite (SW) , verglichen mit dem ¹³ C - NMR - Spektrum und so durch geringere spektrale Auflösung gekennzeichnet. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2. Die ¹³ C NMR - Analyse. 213.81 (A) und 125,77 MHz (B) ¹³ C-NMR - Spektrum einer Fischölergänzung in CDCl & _sub3 ; -Lösung in der Carbonylkohlenstoff Region. Die NMR - Signale von EPA und DHA auf sn -1,3 und sn - 2 - Position gezeigt sind. Diese Signale können für die quantitative Bestimmung von EPA und DHA verwendet werden. Obwohl die spectra bei 213.81 MHz aufgezeichnet wird durch eine höhere Auflösung und Empfindlichkeit gekennzeichnet, die 125,77 MHz-Spektren können auch für die Bestimmung der wichtigsten Verbindungen verwendet werden. Die Anwendung der Entkopplung im ¹³ C - NMR - Experiment eliminiert die Wirkung der skalare Kopplung zwischen den Kohlenstoff- und Wasserstoffkernen und damit die Signale werden als Singuletts die Analyse einfacher im Vergleich zu dem ¹ H - NMR - Spektrum zu machen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3. Fischöl Oxidation. Das ¹ H NMR - Spektrum von oxidiertem Fischöl ist abhängig von den Oxidationsbedingungen. Die Resonanzen zu Hydroperoxiden zugeschrieben (δ 8,0-8,8), conjugated Diene Hydroperoxide (δ 5,4-6,7) und Aldehyde sind gezeigt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Tabelle 1: Die Zuordnung der ¹ H - NMR - Spektrum. Das ¹ H-NMR - chemische Verschiebungen von Fischöl - Fettsäure - Signalen , die für die Quantifizierung Zwecke verwendet werden können , in CDCl ₃ -Lösung vorgelegt. Die chemischen Verschiebungen sind in ppm und geben Aufschluss über die chemische Umgebung des Kerns gemessen.

Tabelle 2: Die Zuordnung der ¹³ C - NMR - Spektrum. Die ¹³ C-NMR - chemischen Verschiebungen von Fischöl - Fettsäure - Signale , die für die Quantifizierung verwendet werden können purpOsen in CDCl ₃ -Lösung vorgelegt.

Supplemental Abbildung S1: Vergleich zwischen den ¹³ C - NMR - Spektren erfasst die Standard - Breitband - Entkopplung unter Verwendung (A) und die inversen (B) Impulsfolgen gated entkoppeln. Die Spektren wurden für die gleiche Probe mit der gleichen Anzahl von Abtastungen aufgezeichnet wird, mit den gleichen Verarbeitungsparametern verarbeitet und werden mit dem gleichen Skalierungsfaktor gezeigt. Bitte klicken Sie hier , um diese Figur zum Download bereit .

Technische Änderungen und Strategien zur Problemlösung

Spectral Qualität. Die Linienbreite des NMR-Signals und damit die Auflösung des NMR-Spektrums ist in hohem Maße abhängig von Shim, die ein Verfahren zur Optimierung der Homogenität des Magnetfeldes ist. Für die Routineanalyse ist 1D Shim ausreichend und eine 3D-Shim nicht erforderlich ist, da es durch NMR-Personal in regelmäßigen Abständen durchgeführt wird. Ist dies nicht der Fall ist, muss ein 3D - Shimming vor der Analyse durchgeführt werden , unter Verwendung einer Probe , die 0,6 ml H ₂ O: D ₂ O (90:10). Um eine bessere und schnellere Shimming zu erreichen, muss die Probe in der Anregungs- / Detektionsbereich der Funkfrequenz (RF) -Spule zentriert werden, die abgestufte Tiefenmesser verwendet wird, bevor es in der Magnetbohrung angeordnet ist. Ein weiterer Faktor, Shim beeinflusst, ist die Probe bei einer Spinnrate von 10 bis 20 Hz zu drehen. Obwohl Spinnen die Probe bei dieser Spinnrate verbessert die radialen Beilagscheiben (X, Y, XY, XZ, YZ, X ² -Y ^2, etc.), ist es im allgemeinen nicht empfohlen , um das Auftreten von Rotationsseitenbändern der ersten oder höherer Ordnung zu vermeiden. Wenn jedoch auf den Instrumenten arbeiten, die in Larmor arbeiten Frequenzen unterhalb 400 MHz, Spinnen ist für 1D-NMR-Experimente empfohlen.

Auflösung, sowie die Empfindlichkeit, werden durch die Empfängerverstärkung (RG) Wert beeinflusst. Niedrige Werte der Empfängerverstärkung zu reduzieren, die Empfindlichkeit, während Werte größer als entsprechende Ursache Überlauf des Analog-Digital-Wandler (ADC). ADC Überlauf führt nicht symmetrische Linienformen und die Signale können nicht für quantitative Zwecke verwendet werden, da die ersten Punkte des freien Induktionszerfalls (FID) verloren gehen können. In den meisten Fällen berechnet der Befehl „RGA“ einen entsprechenden rg Wert. Jedoch in einigen Fällen ist der rg-Wert von der Software berechnet, höher als der Idealwert und es gibt eine Verzerrung in der Lorentz-Form des NMR-Signals. Imeinem solchen Fall sollte der Benutzer manuell eingegeben einen kleineren Wert von rg „rg (value)“ in die Befehlszeile eingeben. Ein typischer Wert RG für die Proben, die mit diesem Protokoll analysiert 8.

Oft, wenn mit einem hohen Qualitätsfaktor (Q-Faktor), eine große Verzögerung (Totzeit)> 200us zwischen dem letzten Impuls und dem Erfassungsperiode kryogen gekühlten NMR-Sonden verwendet, ist erforderlich, um Artefakte zu vermeiden, wie beispielsweise ein Buckel um die Frequenz des Senders und ein Einrollen der Grundlinie des Spektrums. Jedoch ist eine solche lange Verzögerung verursacht eine große negative erste Ordnung Phasenfehler, die ebenfalls eine Basislinie Roll- und große Einbrüche um die Basis der starken Signale einführen kann. In diesen Fällen werden eine z-wiederhergestellt Spin-Echo - Pulssequenz kann NMR - Spektren zu erzeugen , mit deutlich verbesserten Basislinien verwendet werden, obwohl eine geringe Empfindlichkeitsverringerung ²³ auftreten kann.

Phospholipiden. Neben der Analyse von FischölProben reich an Triglyceriden und Ethylester, NMR kann für die Analyse von Fischölproben reich an Phospholipiden (PLs) verwendet werden. Allerdings ist besondere Sorgfalt für solche Proben erforderlich, da PLs Aggregate bilden, die eine deutliche Verringerung der spektralen Auflösung und Empfindlichkeit verursachen können. Für die Analyse dieser Proben, ein Lösungsmittelgemisch aus deuteriertem Chloroform: Methanol (CDCl _3: CD ₃ OD) in einem Verhältnis von 70:30 für den Erhalt Spektren von hohen Qualität erforderlich.

Interner Standard. BHT wurde als interner Standard in dieser Studie ausgewählt , weil es ein sehr symmetrisches Molekül mit einfachen ¹ H und ¹³ C - NMR - Spektren und keine ihrer Peaks überlappen , mit denen der Fischölbestandteilen . BHT ist ein Signal im ¹ H - NMR - Spektrum, das bei δ 6,97 als Singulett erscheint und gehört zu den zwei äquivalenten aromatischen Protonen (para - Stellung in bezug auf die OH - Gruppe) und ein Signal anδ 151.45 im ¹³ C - NMR - Spektrum , das Lager , das die -OH - Gruppe an dem aromatischen quartären Kohlenstoff gehört. Beide Signale haben keine Überlappung mit einem der Bestandteile in Fischöl und können damit zur Quantifizierung Zwecke nutzen. Andere Verbindungen , wie 1,2,4,5-Tetrachlor-3-nitrobenzol (TCNB) oder Ethylenchlorid können auch als alternative interne Standards verwendet werden, sie aber durch längeren T ₁ -Werte charakterisiert sind.

Einschränkungen der Technik

Die Quantifizierung der verschiedenen Fettsäuren und Lipiden in Fischöl wird durch die Integration der geeigneten Diagnose NMR-Signale in den 1D Spektren erreicht. Solche Signale sollten nur auf eine bestimmte Probenkomponente gehören und keine Interferenz mit Signalen von anderen Verbindungen haben. Dies kann ein Problem für ¹ H - NMR - Analyse, da das ¹ H NMR - Spektrum mit geringer Auflösung aufgrund des kurzen Bereich von che auszeichnetmische Verschiebungen. Zusätzlich erzeugt das Vorhandensein von skalaren Kopplung (J) Multipletts und macht die Analyse komplizierter. Beispielsweise Ethylester (EE) kann unter Verwendung von ¹ H NMR durch die charakteristische Triplett (J = 7,20 Hz) der Methylgruppe bei δ 1,25 und das Multiplett bei δ 4,12, der gehört zu den Methylenprotonen der Estergruppe werden quantifiziert. Wenn jedoch in Larmor NMR Instrumenten Betriebsfrequenzen von weniger als 850 MHz, die Analyse von EE unter Verwendung von ¹ H NMR soll wegen der teilweise Überlappung der bei bei δ 4,14 von TGs δ 4,12 mit der Spitze Spitze vermieden werden, und die Überlagerung von das Signal bei δ 1,25 mit dem breiten Signal der aliphatischen Methylenprotonen bei δ 1,23-1,35. Große Abweichungen wurden auch zwischen der ¹ H und ¹³ C - Analyse von EPA in einigen Proben beobachtet, ¹³ C - NMR war näher an der markierten Zusammensetzung durch t bereitgestellter Hersteller. Dies ist wahrscheinlich aufgrund der Überlappung des Signals bei δ 1,69, die für die EPA - Analyse verwendet wird, mit Signalen von anderen Verbindungen , die in einigen Arten von Fischölergänzungen erscheinen. Zusätzliche Fehler in Quantifizierungen können entstehen, wenn ein interner Standard aufgrund der unsicheren Reinheit des internen Standards und von Fehlern beim Wiegen mit.

Die Analyse der Zusammensetzung kann in relativen molaren Konzentrationen ohne die Verwendung eines internen Standards ausgedrückt werden. Wenn die Ergebnisse in absoluten Konzentrationen exprimiert werden müssen, beispielsweise als Milligramm Fettsäure pro Gramm Öl (mg / g) wird die Verwendung eines internen Standards erforderlich. Jedoch in Fällen, in denen das NMR-Signal von Interesse für mehrere Verbindungen mit unterschiedlichen Molekulargewichten gehört, können die Ergebnisse nicht als mg / g ausgedrückt werden, selbst wenn ein interner Standard verwendet wurde. Darüber hinaus erhöht die Verwendung von internen Standards in der Regel die Länge der Analyse, da die am häufigsten internen s TANDARDS, wie BHT, sind kleine Moleküle mit hohem Molekular Symmetrie, die in langen Relaxationszeiten führt. Da die Wiederholungszeit (Verzögerung zwischen Impulsen + Erfassungszeit) eingestellt ist entsprechend der längste Relaxationszeit T ₁ in der Probe, ist die Verwendung eines internen Standards wird die Dauer der Experimente erhöhen längere Verzögerungen zwischen den Pulsen erforderlich sind. Dies ist ein besonders wichtiger Faktor für die ¹³ C - NMR - Analyse wegen der außergewöhnlich lange T ₁ -Relaxationszeit der Kohlenstoffkerne. Die Zugabe einer paramagnetischen Verbindung, wie Cr (acac) ₃ kann die T ₁ -Relaxationszeit effizient reduzieren. Die empfohlene Konzentration von Cr (acac) ₃ 0,75 mg / ml Lösung. Höhere Konzentrationen von Cr (acac) ₃ können zur weiteren Reduktion der T ₁ wird jedoch in Betracht gezogen werden, Vorsicht ist erforderlich , um Abnahmen in dem S / N aufgrund der Linienverbreiterung zu vermeiden.

Beschränkungen in der Empfindlichkeit und die Auflösung der NMR-Spektren verhindern, dass die Analyse von vielen kleinen Verbindungen, die in Fischöl, das mit anderen Techniken, wie GC analysiert werden kann. Zum Beispiel ist ¹ Η NMR leider nicht möglich , einzelne Sterole oder Fettsäuren (zB Palmitinsäure und Stearinsäure) , wohingegen ¹³ C trennenist nicht in der Lage Verbindungen zu bestimmen , die in sehr geringer Konzentration in Fischöl wie Dodecansäure und Myristinsäure erscheinen, die bei δ 173,24 und 172,82 δ mit den Signalen aller gesättigten Fettsäuren überlappen. Obwohl die Erhöhung der Menge der Probe, die die Analyse von einigen geringfügigen Verbindungen möglich macht analysiert wird, ist Vorsicht bei sehr konzentrierten Proben erforderlich, die aufgrund ihrer erhöhten Viskosität. Sehr viskose Lösungen mehr als 150 mg Öl enthalten , vermieden werden sollten , weil es eine Abnahme im S / N ist auf die Linienverbreiterung durch die reduzierten Spin-Spin - T ₂ Relaxationszeiten verursacht. Darüber hinaus längere Verzögerungen zwischen den Pulsen benötigt wegen der längeren T ₁ und es gibt einige Probleme in Shim und damit in Auflösung.

Alle analysierten Verbindungen in Fischöl mit NMR können ohne Verwendung von Trenn- oder Reinigungsschritten gleichzeitig in einer Momentaufnahme quantifiziert werden. Die NMR eineralysis schnell ist wie das ¹ H - Spektrum kann in weniger als einer Minute aufgezeichnet werden, während die ¹³ C - NMR - Akquisition 10 min dauert. Es sollte jedoch beachtet werden, dass es ein paar Faktoren, die die Datenerfassungszeit beeinflussen. Insbesondere wird für ¹³ C NMR, kann die 10 min Laufzeit nur ohne den Einsatz von internen Standards erreicht werden, und mit der Verwendung von kryogen gekühlten Sonden, in dem die HF - Spule und der Vorverstärker gekühlt werden und damit das thermische Rauschen minimiert wird. Ein 10-15 - fache Zunahme in der Versuchszeit sollte für die ¹³ C - NMR - Analyse bei Raumtemperatur (konventionell) Sonden verwendet werden , erwartet werden.

Bedeutung in Bezug auf bestehende Methoden

NMR-Spektroskopie erwies sich als ein leistungsfähiges Werkzeug für die qualitative und quantitative Bestimmung der Zusammensetzung von Fischölergänzungen sein, und wegen seiner Schnelligkeit sie das Potenzial hat, die für den Hochdurchsatzscreening von einer großen nu angewandt werden mber von Fischölproben. NMR-Spektroskopie ist per Definition eine quantitative Methode, da der Signalbereich auf die Anzahl der Kerne direkt proportional ist, die das Signal verursachen. Während akut toxische Chemikalien benötigt werden NMR - Proben herzustellen, ist dieses Verfahren umweltfreundlich , da solche kleine Mengen dieser Chemikalien (zB CDCl ₃₎ verwendet werden , wie im Gegensatz zu anderen Verfahren , die großen Mengen an Lösungsmitteln erfordern Proben zu eluieren. Zusätzlich hat NMR mehrere Vorteile im Vergleich zu anderen analytischen Methoden. Keine Kalibrierung mit Standards wird vor der Analyse und eine minimale Probenvorbereitung ohne Trenn- und Reinigungsschritte wird in der Regel angenommen, was macht NMR ein sehr schnelles analytisches Werkzeug erforderlich. Zusätzlich ist ¹³ C - NMR die beste verfügbare Methode , um die Positionsverteilung verschiedener Fettsäuren auf dem Glycerin Skelett zu bestimmen. Während die enzymatische Hydrolyse als Alternative verwendet worden ist nicht immer zuverlässig= "xref"> 24. Dies ist von besonderer Bedeutung , weil es ein großes Interesse ist bei der Untersuchung der Regiospezifitat verschiedener Fettsäuren in Lebensmitteln, wie es gefunden wurde , dass dies in der menschlichen Ernährung ihre Funktion beeinträchtigt ^{25, 26.}

zukünftige Anwendungen

Trotz der Einigung zwischen NMR-Analyse und die Label Produkten, sowie die Tatsache, dass es einige Studien zeigen Vereinbarung zwischen GC und NMR, glauben wir, dass mehr strenges und umfassendes innerLaborStudien, die Vereinbarung zwischen NMR und traditionell zu untersuchen ist erforderlich Methoden zur Analyse von Fischölbestandteilen eine größere Anzahl von Proben, Fischöl Produkten unterschiedlicher Herkunft und zertifizierten Standardlösungen.

Eine weitere wichtige zukünftige Anwendung der NMR in Fischöl-Analyse wird die Bestimmung der Oxidationsprodukte sein. Neben der Bestimmungder wichtigsten Verbindungen, die in Fischöl sind mehrere primäre und sekundäre Oxidationsprodukte in Fischöl, wie Aldehyden und Peroxiden, vorhanden. ¹ H NMR kann potentiell für die Auswertung des Oxidationsstatus in Fischtranergänzungen angewandt werden, unter verschiedenen Oxidationsbedingungen, wie in Abbildung 3 gezeigt. Die größte Herausforderung bei dieser Analyse wird die NMR-Zuordnung und die Identifizierung einzelner Oxidationsprodukte sein. Fortschritte in der Empfindlichkeit der NMR - Hardware wird auch die Identifizierung einzelner Sterole ermöglichen Verwendung ¹³ C - NMR. NMR-Spektroskopie kann auch für die Analyse von Fischgewebe als auch ohne Extraktion unter Verwendung von High Resolution Magic Angle Spinning (HR-MAS) NMR ganze angewendet werden.

Kritische Schritte im Rahmen des Protokolls

Zwei der wichtigsten Schritte, die die Genauigkeit der quantitativen NMR-Spektren beinhalten die Auswahl eines 90 ° Impulses und die Verwendung einer Verzögerung zwischen pu auswirkenLSEs ≥ 5 × T _1. Der Pulswinkel ist proportional zur Impulsbreite, die ein kalibrierte NMR-Parameter ist, die auf der Instrumentierung und die Probe abhängig ist. A 90 ° -Impuls ist wesentlich für die vollständige Umwandlung von longitudinalen (z) Magnetisierung auf beobachtbaren Quer (xy) Magnetisierung. Es ist wichtig, dass vor dem Impuls Kalibrierung beachten Sie, dass die NMR Bedürfnisse sondiert werden gut abgestimmt und angepasst. Dadurch wird die Übertragung der HF-Leistung auf die Probe optimieren und somit S / N maximieren und effektive Entkopplung gewährleisten. Die Sonde tuning wird meist durch die Dielektrizitätskonstante der Probe beeinflusst, so dass, wenn es Unterschiede in der Konzentration zwischen den Proben sind, wiederholen Sie den Abstimmvorgang für jedes. Das 1D - ¹³ C - NMR - Experiment beinhaltet sowohl ¹³ C und ¹ H - Kanäle so automatische Abstimmung und Anpassung ist für beiden Kerne erforderlich.

Eine Verzögerung zwischen den Pulsen länger als 5 × T ₁ gewährleistet die vollständige recovery der Nettomagnetisierung auf seinen Anfangswert. Wenn alle Resonanzen im Spektrum vollständig nicht vor jedem Puls entspannt wird das Signal teilweise unterdrückt und dies führt zu Ungenauigkeiten bei der Integration. T ₁ - Wert ist ein kritischer Faktor, der die Länge des Experiments beeinflusst und es hängt von der magnetischen Feldstärke als auch die Viskosität der Probe. Nur am Anfang der Analysesitzung gegeben , dass die Viskosität zwischen den Proben ähnlich ist, sollte T ₁ Relaxationszeiten für jedes Instrument bestimmt werden.

Ein weiteres wichtiges Merkmal der Fischöl - Analyse mit ¹³ C - NMR , ist die Auswahl der geeigneten Impulsfolge. Das zuverlässigste Verfahren für die quantitative ¹³ C - Analyse ist die inverse Entkopplungsexperiment gated, wo Breitbandprotonenentkopplung nur während der Erfassungsperiode angelegt wird , und somit gibt es keinen Polarisationstransfer von ¹ h bis ¹³C über den Kern-Overhauser-Effekt (NOE). Während jedoch das vollständig entkoppelte NMR Experiment kann für quantitative Zwecke verwendet wird, ist Vorsicht geboten, wenn dieses Experiments unter Verwendung, weil es verschiedene NOE Faktoren unter Kohlenstoff mit verschiedenen Multiplizitäten sind und damit integral Vergleich zwischen Methyl, Methylen, Methan und Carbonylkohlenstoffatome müssen vermieden werden. Trotzdem, wenn nur Kohlenstoff ähnlicher Vielfalt und chemischer Umgebung sind in der Analyse berücksichtigt, sind die vollständig entkoppelten Verfahren zuverlässig. Ein Beispiel hierfür ist Carbonylkohlenstoffatome von Fettsäuren , die gefunden wurden , nach dem Entkoppeln ²⁷ keine signifikanten Unterschiede in den NOE Faktoren haben. Darüber hinaus ist für Kohlenstoff Lager Protonen liefert das vollständig entkoppelte Experiment höhere Empfindlichkeit aufgrund der NOE Beiträge auf der NMR-Signalintensität. Ein Vergleich zwischen den Spektren , die mit den zwei Pulssequenzen gewonnen ist in Fig S1 gezeigt.

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Diese Arbeit wurde durch die Nahrungsmittel für Gesundheit Entdeckung Thema an der Ohio State University und das Institut für Lebensmittelwissenschaft und Technik an der Ohio State University unterstützt. Die Autoren möchten sich die NMR-Einrichtung an der Ohio State University und die NMR-Einrichtung an der Penn State University danken.