Method Article
Dieses Protokoll nutzt sowohl die Untereinheit Koexpression und postlysis Untereinheit für eine gründlichere Untersuchung der rekombinanten Assemblierungsintermediate mischen.
Proteasomen sind in allen Bereichen des Lebens zu finden. Sie bieten den Hauptweg der intrazellulären Proteinabbaus in Eukaryoten, obwohl ihre Montage nicht vollständig verstanden wird. Alle Proteasomen enthalten einen strukturell konservierten Kernpartikel (CP) oder 20S-Proteasoms, die zwei heptameren Ringe β-Untereinheit zwischen zwei heptameren α-Untereinheit Ringe eingeklemmt. Archaeal 20S Proteasomen sind kompositorisch einfacher im Vergleich zu ihren eukaryotischen Kollegen, aber sie beide teilen eine gemeinsame Montagemechanismus. Folglich weiterhin Archaea 20S Proteasomen wichtige Modelle für eukaryotische Assemblierungsintermediate zu sein. Insbesondere wurde die rekombinante Expression von Archaea-20S Proteasomen in Verbindung mit nicht-denaturierenden Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) viele wichtige Einblicke in Proteasom-Biogenese ergab. Hier diskutieren wir ein Mittel auf die übliche Strategie der Co-Expression von Archaea-Proteasom-α zu verbessern und ß-Untereinheiten vor nondenaturing PAGE. Wir zeigen, dass, obwohl eine schnelle und effiziente, eine Co-Expression Ansatz allein Schlüssel Assemblierungsintermediate verpassen. Im Falle des Proteasoms, Koexpression erlauben nicht Detektion des Halb Proteasom, ein Zwischenprodukt, enthaltend ein vollständiges α-Ring und eine vollständige β-Ring. Jedoch ist dieses Zwischenprodukt wird leicht über Lysat Mischen detektiert. Wir schlagen vor, dass die Co-Expression mit Lysat Mischung kombiniert einen Ansatz ergibt, die bei der Analyse der Montage gründlichere ist, bleibt doch Arbeit nicht-intensiven. Dieser Ansatz kann für die Untersuchung von anderen rekombinanten Multiproteinkomplexen nützlich sein.
Multiproteinkomplexen führen zahlreiche kritische zelluläre Aktivitäten 1. Für viele dieser Komplexe wird über ihre Struktur und Funktion viel mehr bekannt als über ihre Montage 2,3. Das Proteasom ist ein solcher Komplex und wird in allen Lebensbereichen zu finden. In Eukaryonten ist diese molekulare Maschine am Kern des Ubiquitin / Proteasom - System (UPS) und stellt den Hauptweg der intrazellulären Proteinabbau 4. Die eukaryotische Proteasom (bezeichnet als 26S Proteasom) besteht aus zwei Hauptunterbaugruppen: eine 20S Proteasom oder Kernteilchen (CP) 5, die durch einen 19S Regulatory Particle (RP) 6 an einem oder beiden Enden verschlossen sein.
Das 20S-Proteasom ist ein großer compartmentalized Protease. Seine Quartärstruktur ist absolut in allen Lebensbereichen erhalten und besteht aus einem Stapel von vier siebengliedrige Ringe, die zwei Arten von strukturell verwandte Untereinheiten, α; und ß 5,7,8. In Eukaryoten sind die beiden Außenringe jeweils aus sieben verschiedenen α-Untereinheiten und die beiden Innenringe jeweils aus sieben verschiedenen β-Untereinheiten; proteolytische Aktivität liegt innerhalb drei der β-Untereinheiten. Im Gegensatz dazu werden die CP Ringe aus Archaea und Bakterien in der Regel nur aus einer Art von α und einer Art von β-Untereinheit zusammen. Archaeal Proteasomen sind ein wichtiges Modellsystem zum Studium Assemblierungsintermediate sowohl aufgrund ihrer kompositorischen Einfachheit zur Verfügung gestellt und ihre gemeinsame Montagemechanismus mit ihren eukaryotischen Pendants 9-13 teilen. Kurz gesagt, montieren α-Untereinheiten in α Ringe erste, die dazu dienen als Gerüst, auf die ß-Untereinheiten zusammenstellen. Die resultierenden Halb Proteasomen (α 7 β 7) dimerisieren Hierdurch entstehen zu komplett montierten CP (α 7 β 7 β 7 α 7). Während Dimerisierung präsentieren die Propeptide auf ß-Untereinheitenautokatalytisch entfernt werden, um die katalytischen N-terminalen Threonine auszusetzen. Die Verwendung von Archaea - Proteasomen Baugruppe Modell nimmt häufig die Vorteile der Herstellung von rekombinanten Proteinen archaeal Proteasom in Escherichia coli. Dies ist eine sinnvolle Annäherung, weil es ermöglicht, die Untereinheiten in verschiedenen Kombinationen hergestellt werden, da sowohl WT und Mutanten-Versionen in einem Wirtsorganismus, der keine eigene Proteasomen erzeugt.
Die Überwachung der Montage von Multiproteinkomplexen erfordert biochemisch eine Art Fraktionierung Methode, die vollständig zusammengebaut Komplexe von Montage Zwischen- und Vorprodukte trennt. Aufgrund ihrer überlegenen Fähigkeit der Lösung, wurde nicht - denaturierenden Polyacrylamid - Gelelektrophorese (PAGE) in der Fraktionierung der verschiedenen großen Multiproteinkomplexe besonders nützlich 14-17 erwiesen. Die Kombination von rekombinanten Archaea Proteasom Produktion und nicht denaturierenden PAGE hat sich zu einem leistungsfähigen Ansatz in dissectin werdeng Assemblierungsintermediate 9,11,12,18. Jedoch ist das übliche Verfahren , mit dem dieser Ansatz angewendet (dh. Über die rekombinante Koexpression von α und β - Untereinheiten) hat einen wichtigen Nachteil. Montage Reaktionen sind kooperativ und stark konzentrationsabhängig 3. Da die Proteinkonzentration innerhalb der Zellen ist sehr hoch 19, aufgrund ausgeschlossen Volumeneffekte, Montage Reaktionen verlaufen schnell in vivo. Daher ist es möglich, wichtige Assemblierungsintermediate wenn α und β-Untereinheiten koexprimiert werden zu verpassen.
Hier streiten wir für einen kombinierten Ansatz bei der Untersuchung von Assemblierungsintermediate rekombinanten Archaea Proteasom-Untereinheiten verwendet wird. In diesem Ansatz werden beide Koexpression und Lysat Mischverfahren eingesetzt. Erstere ermöglicht eine schnelle Analyse der Montage, da die Co-Expression weniger arbeitsintensiv ist. Letzteres hängt von getrennten Expression von α und β-Untereinheiten, gefolgt von Mischen. Obwohl dieser requires etwas mehr Aufwand als Koexpression, ist es mehr als kompensiert durch die Fähigkeit, Zwischenprodukte zu erfassen, die während der Coexpression verpasst werden. Zusammen können diese beiden Methoden, um ein vollständigeres Bild der Assemblierungsintermediate liefern.
1. Bakterielle Expression.
Anmerkung: Expressionsplasmide in dieser Studie verwendet wurden, sind in Tabelle 1 beschrieben. Lösungen, Medien und Puffer in dieser Studie verwendet wurden, sind in Tabelle 2 beschrieben. Die Klonierung von Archaea - Proteasom - Untereinheit - Gene und die Erzeugung von Expressionsplasmiden sind an anderer Stelle beschrieben 18,20. Kurz gesagt, Plasmide für die rekombinante Koexpression von Untereinheiten verwenden eine bizistronischen Operon - Strategie , die bei der Beschaffung von 18,20 vergleichbaren Expressionsniveaus der einzelnen Untereinheiten hilft. Die Expressions unten aufgeführten Parameter wurden empirisch bestimmt für die Proteasom-Untereinheiten in dieser Studie als optimal. Es kann notwendig sein Ausdruck für andere Proteasom-Mutanten zu optimieren, für Proteasomen aus anderen Archaea Arten oder für andere rekombinante Protein-Komplexe (siehe Diskussion).
2. Bakterienlyse und Lysate Mischen.
Hinweis: Für Proben, über die Co-Expression untersucht, Abschnitt 2.1 (und seinen Unterabschnitten) folgen. Für Proben Lysat Mischen erfordern, folgen Sie Abschnitt 2.2 (und seine Unterabschnitte). Der TSP (Total, Lösliche, Pellet) Analyse, die im Protokoll enthalten ist, ist nützlich in der Proteinexpression zu optimieren, die die α und β-Untereinheiten während des Lysats kombiniert mischen (siehe Diskussion) dazu beitragen kann etwa gleiche Mengen an. Es bietet auch eine wichtige Kontrolle , wenn Downstream - Ergebnisse nicht wie erwartet (dh überprüft er , dass Protein exprimiert wurde und löslich). Daher empfehlen wir dringend zunächst TSP Analyse. Sobald ein optimales Protokoll für eine bestimmte Untereinheit-Kombination erreicht worden ist, wird TSP Analyse nicht unbedingt erforderlich, weshalb er als optional weiter unten beschrieben wird.
3. Proteinaufreinigung über immobilisiertem Cobalt Affinity Resin(ICH AUTO).
4. nicht-denaturierenden Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE).
Achtung: Unpolymerisiertes Acrylamid ist ein Neurotoxin. Tragen Sie geeignete Schutz gear.
5. Visualizing Aktivität und Protein-Färbung.
Assemblierungsintermediate (Abbildung 1) beginnt , wenn alpha - Untereinheiten zu bilden Ringe 9 zu kombinieren. Dies kann veranschaulicht werden , wenn & agr; -Untereinheiten von der archaeon Methanococcus maripaludis S2 in E. coli exprimiert werden , wie C-terminal Hexahistidin - markierte (His-tagged) -derivate (Tabelle 1). Wenn die rekombinante α-His - Protein durch ICAR und analysiert wurde gereinigt durch nicht - denaturierende PAGE, zwei Banden beobachtet (2A, Spur 1). Wir haben bereits gezeigt , dass diese entsprechen Einzel α Ringe (SR) und Doppel - α-Rings (DR) 18. Die DR ist eine Sackgasse Arten , die nicht produktiv für die spätere Montage 9,18 ist.
Wenn & agr; -Untereinheiten-His wurden mit β-Untereinheiten koexprimiert, das übliche Verfahren darstellt, durch die Anordnung von rekombinantem archaeal Proteasomen getestet wird, wurde eine neuartige Spezies beobachtet in der Nähe des 670 kDa Größe Stand der Migrationard (2A, Bahn 3). Diese Art war proteolytisch aktiv (2B, Spur 3) und enthielt nur vollständig reifen β - Untereinheiten (mβ) , deren Propeptide entfernt worden sind (2C, Spur 3). Diese Art ist die voll ausgereift CP. Diese Probe enthielt auch einige SR-Arten, die erwartet wurde, weil SR eine bekannte Montagezwischen, aber keine DR-Spezies ist. Der Mangel an DR , wenn a-sein und ß - Untereinheiten schlägt koexprimiert , dass eine korrekte Montage auftrat schnell genug ist, so daß der Einbau von β - Untereinheiten der Lage war , die unproduktive Bildung von DR zu outcompete (18 für eine detailliertere Darstellung).
Um die Begrenzung der Koexpression Verfahren demonstrieren und sprechen für die Brauchbarkeit eines kombinierten Ansatzes α-his und & bgr; -Untereinheiten wurden separat in E. coli exprimiert. Nach der Lyse wurden die löslichen Fraktionen gemischt und Proteine durch ICAR gereinigt wurden vor derAnalyse von nicht-denaturierenden PAGE. Voll funktions Proteasomen wurden auch über das Lysat Mischungsansatz (2A und 2B, Spur 2) erzeugt und die SR - Spezies wurde auch als erwartet beobachtet. Das Wiederauftreten der DR Spezies in der Lysatprobe Mischen zeigt an, dass einmal gebildet, β-Untereinheiten nicht in der Lage sind, um es reversibel zu zerlegen; Dies unterstreicht die Sackgasse Natur des DR. Interessanterweise ist eine neue Art erschien auch in der Probe Lysat Mischen, direkt unterhalb des CP Migration (bezeichnet als "halbe"). Vor kurzem haben wir gezeigt , dass diese Art der Halb Proteasom entspricht (alpha 7 β 7) 18. Um dies zu veranschaulichen dabei eine β-Untereinheit-Mutante (R166W) wurde verwendet. Diese Mutation stört β-β - Ring - Interaktion, 18 zu einer Beeinträchtigung der Halb Proteasomen Dimerisierung führt. Da Halb Proteasomen die unmittelbaren Vorläufer zu CP sind, sollte die R166W Mutation sowohl Ansammlung von Halb Proteasomen ein führenda Abnahme der CP-Bildung. Wenn Lysats mit α-his und β (R166W) -Untereinheiten Mischen wurde durchgeführt, geringere Mengen an CP und erhöhte Niveaus der "halben" Spezies beobachtet (2A, Spur 4). Dies ist mit einem Vorläufer-Produktbeziehung für diese zwei Bänder konsistent und bestätigt die Identität der "halben" Spezies wie der Halb Proteasom. Die etwas schnellere Migration des Halb Proteasom in der Mutante Probe (Spur 4 gegenüber Spur 2) dürfte aufgrund der R166W Mutation Veränderung der Masse-Ladungs-Verhältnis der β-Untereinheit.
Die Fähigkeit, die Halb Proteasom während Lysat Mischen zu visualisieren, wie den hohen Proteinkonzentrationen in Zellen verglichen hauptsächlich auf viel niedrigeren Proteinkonzentrationen im Lysat. Niedrigere Konzentrationen führen zu weniger effizient (dh langsamer) Montage, die Zwischenprodukte ermöglicht bevölkerten zu werden und somit nachweisbar. Neben dem Erscheinen des Halb Proteasom, eine zusätzliche Beobachtung unterstreicht die verminderte Montageeffizienz während Lysat Mischen: nicht verarbeitete β-Untereinheiten, die ihre Propeptide behalten, werden nachweisbar (proβ). Da Propeptid Verarbeitung bis Halbproteasomen dimerisieren nicht auftritt, korreliert das Aussehen des unreifen proβ Form mit dem Niveau der Halb Proteasom Akkumulation (vergleiche 2C, Spur 3 im Vergleich zu Spur 2 im Vergleich zu Spur 4). Im Falle der Mutante R166W, ist die Propeptid-Verarbeitungsfehler während Lysat Mischen absolute obwohl eine kleine Menge von CP bildet. Dies liegt daran , Propeptid Verarbeitung erfordert nicht nur Halb Proteasom Dimerisierung, aber auch eine einwand gebildete β-β - Ring - Schnittstelle 23 , die die Mutation R166W leisten nicht. Eine ausführlichere Erzählung von Co - Expression im Vergleich zu Lysat Mischen, wie es um rekombinante Assemblierungsintermediate betrifft, gibt es hier 18 gefunden.
Abbildung 1 "src =" / files / ftp_upload / 54860 / 54860fig1.jpg "/>
Abbildung 1: ein vereinfachtes Schema Kernteilchen (CP) Versammlung.
Die α-Untereinheiten kann in einem einzigen α-Ring montieren erste (SR), die für den Einbau von β-Untereinheiten als Vorlage dient. Dies führt zur Erzeugung des Halb Proteasom-Zwischenprodukt (die Hälfte), die rasch dimerisiert. Gleichzeitig mit Dimerisierung werden die β-Untereinheit Propeptide (nicht gezeigt) mit dem voll funktionsfähigen Kernteilchen (CP) BEGRÜNDE autokatalytisch entfernt. Doppel α-Ringe (DR) von SR entstehen und sind nicht zuständig für die Montage in CP. Ihre Bildung stellt eine unproduktive Montage Weg (gestrichelte Pfeil) im Gegensatz zu produktiven Montage Ereignisse (durchgezogene Pfeile). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Ein kombinierter Ansatz zur Untersuchung von Proteasom Versammlung.
Coexpression (C) und Mischen Lysat (L) wurden M. maripaludis studieren Montage von rekombinantem Proteasomen aus dem archaeon eingesetzt. Die Proteine wurden gereinigt durch immobilisierte Cobalt Affinitätsharz (ICAR). (A, B) Gereinigte Proteine (10 ug) wurden geladen auf nicht denaturierenden von 5 bis 10% Gradienten - Gelen. Nach der Elektrophorese wurde Peptidase - Aktivität sichtbar gemacht, indem das Gel mit Pufferlösung , die über der fluorogenes Peptidsubstrat Suc-LLVY-AMC (B) vor dem Färben des Gels mit kolloidalem Coomassie - Färbung Reagens (A) enthält. Schwarze Pfeile bezeichnen die Positionen der zusammengebauten 20S Kernteilchen (CP), Halb Proteasom Zwischen (die Hälfte), Doppel-α-Ring (DR) und einzelne α-Ring (SR). Die Migration von mehreren molekularen Größenstandards (in kDa) ist rechts angegeben. (C) Gereinigte Proteine (10 ug) von A wurden auf 15% SDS-PAGE - Gele geladen. Nach der Elektrophorese wurden die Gele mit einem kolloidalen Coomassie-Färbung Reagens gefärbt. Migration von α-Untereinheit sein und voll ausgereift (mβ) und unreife (proβ) β-Untereinheiten angezeigt. Die Position des 25 kDa Molekulargrößenstandard ist rechts dargestellt. Asterisk zeigt eine abgeschnittene α-Untereinheit sein Fragment von unspezifischen Proteolyse während der Lyse führt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Plasmid | Genotyp | Quelle |
AKB191 | pET42 PSMA-his | Kusmierczyk et al., (2011) |
AKB464 | pET42 PSMA-his psmB | Kusmierczyk et al., (2011) |
AKB946 | pET42 psmB | Panfair et al., (2015) |
AKB952 | pET42 psmB (R166W) | Panfair et al., (2015) |
Tabelle 1: Bakterienplasmiden in dieser Studie verwendet. PSMA ist die Archaea-α-Untereinheit-Gen und psmB ist die Archaea-β-Untereinheit-Gens.
Puffer A | 50 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl 2. | Puffer B, C, und E, sind Derivate von Puffer A, enthaltend Imidazole. Es ist nützlich, Imidazole aus einer 2 M Lager vorbereitet in Wasser und im Dunkeln aufbewahrt hinzuzufügen. |
Native Lösung Puffer | 375 mM Tris-HCl, pH 8,8, 0,1% (v / v) tetramethyl-Ethylendiamin (TEMED) und 0,1% (w / v) Ammonium Perulfate (APS). | Frisch zubereitet nicht mehr als eine Stunde vor dem Gel polymerisiert werden soll, und auf Eis gehalten. Wenn Acrylamidgel Herstellung von Lösungen in der nativen Lösung Puffer, ist es nützlich, die Tris-HCl aus einem 4X Lager (1,5 M Tris-HCl, pH-Wert 8,8) hinzuzufügen. Der APS zugegeben unmittelbar vor der Polymerisation. |
Mutterlaufpuffer 10X Lager | 250 mM Tris, 1,92 M Glycin, nicht einstellen pH-Wert. | |
5X nativen Probenpuffer | 0,5 M Tris-HCl, pH 8,8, 50% (v / v) Glycerol, Spuren von Bromphenolblau. | Spuren bezieht sich auf eine sehr kleine Menge, in der Regel ein paar Körner über Spatel überführt. |
5X SDS-Probenpuffer | 0,3 M Tris-HCl, pH 6,8, 600 mM Dithiothreitol (DTT), 10% (w / v) SDS, 50% (v / v) Glycerin und Spuren von Bromphenolblau. | Spuren bezieht sich auf eine sehr kleine Menge, in der Regel ein paar Körner über Spatel über. |
Die Entwicklung Puffer | 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl 2, 1 mM ATP, 50 mM Suc-LLVY-AMC. | Suc-LLVY-AMC ist ein fluorogenes Peptidsubstrat verwendet Proteasom-Aktivität zu untersuchen. |
Tabelle 2: Lösungen, Medien und Puffer in dieser Studie verwendet.
Wir zeigen den Nutzen eines kombinierten Ansatzes Assemblierungsintermediate zur Analyse von PAGE unter Verwendung von rekombinanten Archaea Proteasomen nicht denaturierenden. Die übliche Methode 9,11 von bakteriellen Co - Expression von Proteasom - Untereinheiten ermöglicht eine schnelle Analyse kann aber keine Schlüssel Assemblierungsintermediate offenbaren. Wir schlagen vor, die Kombination von Co-Expression mit Lysat Mischen ein umfassenderes Bild von Montage Ereignisse zu entwickeln.
Der Vorteil dieses kombinierten Ansatzes ist, dass trotz erfordern getrennte Expression der α und & bgr; -Untereinheiten für Lysat Mischen, ist es noch relativ arbeitsfreundlich. Die Ergebnisse können auch semiquantitative sein, wenn man vergleichbarer und Expressionsniveaus der einzelnen Proteine gewährleistet. Zu diesem Zweck wird empfohlen, führen wir die übliche Optimierung der Expression rekombinanter Proteine aus Bedingungen zu bestimmen, die vergleichbare Mengen an exprimierten Proteinen Mischens vor Lysat ermöglichen. Die Optimierung kann unterschiedlichen Induktions tim umfassene, Induktionstemperatur, optische Dichte bei Induktion, bakterielle Expressionsstamm, und so weiter, bis die gewünschte Niveaus an löslichem Protein erreicht werden. Dies ist besonders wichtig, wenn WT und Mutanten-Versionen eines Proteins zu vergleichen, weil manchmal die Mutante vergleichbare Expressionsniveaus aufweisen können, aber verringerte Löslichkeit. Wir zeigen auch die Bedeutung Proteinkonzentrationen der ICAR reinigten Proben vor dem Laden der nicht-denaturierenden PAGE zu bestimmen. Auch mit der Expression-Optimierung statt, und mit der besten Sorgfalt, um sicherzustellen, dass parallel Proben durch die Reinigungsschritte in der gleichen Weise verarbeitet werden, Varianz noch versehentlich eingeführt werden kann. Eine Konzentrationsmessung gewährleistet, daß die gleiche Menge an Gesamtprotein ist gut pro Probe geladen. Dies macht Spur-zu-Spur-Vergleiche der Bandenintensitäten für eine gegebene Zugvogelarten aussagekräftiger.
Wenn vergleichbar und ein einheitliches Niveau der Proteinexpression kann nicht für lysa erreicht werdente Durchmischung, kann man immer alle Komponenten reinigen vorher und führen Experimente mit reinen Proteinen zu mischen. Dies hat den Vorteil einer genaueren Proteinbestimmungen ermöglicht und somit macht den Ansatz quantitativ. Jedoch ist der Nachteil einer vollständigen Reinigung dass der Prozess wesentlich arbeitsintensiv wird, die schnelle Analyse von Mehrfachmutanten gleichzeitig 18 ausschließen können. Eine letzte Einschränkung ist erwähnenswert, dass manchmal die Expression von α trennen, und & bgr; -Untereinheiten kann nicht möglich sein. Dies kann auftreten , wenn eine Mutation verursacht eine Untereinheit in E. coli unlöslich zu sein , wenn sie auf seine eigene ausgedrückt erlaubt aber Löslichkeit wiedergewonnen werden , wenn die Mutante mit seinem Bindungspartner exprimiert wird. Wenn dies der Fall ist, wird es Analyse beschränken sich nur auf die Coexpression. Dies ist jedoch eine Einschränkung , die während rekombinanter Proteinexpression im allgemeinen auftreten können, und ist für archaeal Proteasom - Untereinheiten 24,25 nicht spezifisch.
Wir wählten generate his-markierte Derivate unserer proteasomaler Proteine aufgrund von Reinigung und Erschwinglichkeit des ICAR Harz zu erleichtern. Andere Epitopmarkierungen möglich sind, die für Antikörper-basierte Reinigungs einschließlich, und wir haben erfolgreich exprimiert und gereinigt FLAG-markierten Versionen der Proteasom-Untereinheiten (nicht gezeigt). wenn die Reinigung bis zur Homogenität jedoch (oder den Umfang der Produktion zu erhöhen), die erforderlich ist, die seine markierten Versionen bieten die schnellste und kostengünstiges Mittel, dies zu tun.
Es ist eine Selbstverständlichkeit , dass die Ergebnisse mit rekombinanten Proteinen erhalten, werden sie Archaea oder eukaryotische in Bakterien produzierte Proteine, gewinnen weiter , wenn sie mit in vivo Beobachtungen weiterverfolgt Bedeutung. Eine in vivo - Ansatz nicht immer jedoch sofort zugänglich experimentell. Dies gilt insbesondere, wenn der Untersuchungsgegenstand ist ein großes, komplexes Multiunter wie das Proteasom. Recombinant Protein Ansätze für futu einen wichtigen Startpunkt bietenre Experimente. Im Falle des Proteasoms, mit nicht - denaturierenden PAGE wird rekombinante Archaea Proteasom Produktion Paarung weiterhin beim Aufklären der wichtigsten Features von Assemblierungsintermediate sehr wirksam zu sein, die 9,11,12,18 zwischen Archaea und eukaryotischen Spezies geteilt werden. Ein solcher Ansatz ist wahrscheinlich auch für die Untersuchung der Montage von anderen großen Multiproteinkomplexen nützlich. Vor kurzem haben wir diese Strategie zu demonstrieren , dass Archaea Proteasomen über mehr als einen Stoffwechselweg montieren kann, und dass α-Ringe sind nicht die obligate Zwischenprodukte bei der Montage , die sie gedacht wurden 18 sein. Es bleibt abzuwarten, ob das gleiche gilt für die eukaryotische Proteasomen hält.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde teilweise durch einen Research Support Funds Grant (RSFG) von der Indiana University-Purdue University, Indianapolis, und teilweise durch eine Auszeichnung von der American Heart Association 14GRNT20390154, zu ARK unterstützt
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Acrylamide (40%) solution | Biorad | 1610104 | Unpolymerized acrylamide is a neurotoxin. Wear proper protective gear |
Amicon ultra 0.5 mL centrifugal filters | EMDMillipore | UFC501024 | |
Ammonium Persulfate | Sigma | A3678 | |
ATP | Sigma | A7699 | |
BCA assay kit | Pierce | 23225 | |
Bisacrylamide (2%) solution | Biorad | 1610142 | |
Bromophenol blue | Sigma | B8026 | |
DNaseI | Sigma | DN25 | |
Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher | BP172 | |
E. coli BL21 competent cells | EMD Millipore | 69450 | |
GelCode Blue | Thermo Fisher | 24592 | Colloidal coomassie stain reagent for gels |
Gel doc EZ system | Biorad | 1708270 | Gel documentation system |
Gel releasers | Biorad | 1653320 | Wedge shaped plastic used to separate gel plates; useful for spreading liquid. |
Glass rod | Thermo Fisher | 11-380B | |
Glycerol | Sigma | 49767 | |
Glycine | Thermo Fisher | BP3865 | |
Hamilton syringe | Thermo Fisher | 14-813-38 | Glass syringe for loading gels |
HEPES | US Biologicals | H2010 | |
HMW Native calibration kit | GE Healthcare | 170445-01 | High molecular weight protein standards |
Hoefer SG30 | Thermo Fisher | 03-500-277 | Gradient maker |
Imidazole | US Biologicals | 280671 | |
IPTG | US Biologicals | I8500 | For induction of protein expression |
Isopropanol | Thermo Fisher | BP26181 | |
Kanamycin sulfate | US Biologicals | K0010 | |
Lysozyme | Sigma | L6876 | |
MgCl2 | Fluka analytical | 630680 | |
Mini Protean Tetra Cell | Biorad | 1658002EDU | Gel electrophoresis apparatus |
NaCl | Thermo Fisher | S640-3 | |
NaOH | Thermo Fisher | S318-1 | |
Pefabloc SC | Roche | 11429876001 | Protease inhibitor |
pET42 | EMD Millipore | 70562 | Expression plasmid |
Precision plus all blue standard | Biorad | 1610373 | Molecular protein standard for SDS-PAGE |
Quickchange mutagenesis kit | Agilent technologies | 200521 | |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Thermo Fisher | BP166 | |
Suc-LLVY-AMC | Enzo lifesciences | BML P802-0005 | Fluorogenic substrate |
Talon Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | Immobilized Cobalt Affinity Resin |
TEMED | Sigma | T7024 | |
Tris | US Biologicals | T8600 | |
Triton-X100 | Sigma | 93426 | |
Tryptone | Bacto BD | 211699 | |
UV sample tray | Biorad | 1708271 | For UV imaging of gels |
Yeast extract | Bacto BD | 212720 |
Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden
Genehmigung beantragenThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten