Method Article
In diesem Video-Artikel beschreiben wir die in vitro Synthese von modifizierten mRNA zur Induktion der Proteinexpression in den Zellen.
Die exogene Lieferung von Codierungs synthetischen Boten-RNA (mRNA) für die Induktion der Proteinsynthese in gewünschten Zellen hat ein enormes Potenzial in den Bereichen der regenerativen Medizin, Grund Zellbiologie, Behandlung von Krankheiten und Reprogrammierung von Zellen. Hier beschreiben wir eine Schritt für Schritt das für die Erzeugung der modifizierten mRNA mit verringerter Immunaktivierungspotential und eine erhöhte Stabilität, die Qualitätskontrolle des hergestellten mRNA, die Transfektion von Zellen mit mRNA und Verifizierung der Protein-Expression induziert durch Durchflusszytometrie. Bis zu 3 Tage nach einer einzigen Transfektion mit eGFP mRNA, die transfizierten HEK293 Zellen produzieren eGFP. In diesem Video-Artikel wird die Synthese von eGFP mRNA als ein Beispiel beschrieben. Jedoch kann das Verfahren für die Herstellung von anderen gewünschten mRNA angewendet werden. Verwendung des synthetischen modifizierten mRNA können Zellen induziert werden, um vorübergehend die gewünschten Proteine, die sie normalerweise nicht ausdrücken würde auszudrücken.
In Zellen, die Transkription von Messenger-RNA (mRNA) und die folgende Übersetzung der mRNA in die gewünschten Proteine zu gewährleisten das reibungslose Funktionieren von Zellen. Angeborene oder erworbene genetische Störungen können zu einer unzureichenden und dysfunktionale Synthese von Proteinen führen und zu schweren Krankheiten. Somit ist ein neuer Therapieansatz, um die Produktion von fehlenden oder defekten Proteine induzieren die exogene Lieferung von synthetischen modifizierten mRNA in Zellen, die für das gewünschte Protein. Dabei werden Zellen ausgelöst, um funktionelle Proteine, die sie normalerweise nicht produzieren oder wäre natürlich nicht nötig zu synthetisieren. Mit diesem Ansatz können genetische Erkrankungen, die durch Einführung von mRNA korrigiert werden, dass die für das defekte oder fehlende protein 1. Die mRNA-Therapie kann auch für die Impfung verwendet werden, um Protein-Antigene, die von Tumorzellen oder Pathogene exprimiert werden, zu synthetisieren sind. Dadurch kann Immunsystem des Wirts aktiviert werden, effektiv zu eliminieren oder zu verhindern, Tumorzellen InFEctions 2,3. Ferner ist in den letzten Jahren mRNA wurde erfolgreich verwendet, um induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) zu erzeugen. Zu diesem Zweck wurden Fibroblasten mit mRNAs transfiziert, um induzieren die Expression von Reprogrammierungsfaktoren 4-6 und sie in iPS-Zellen mit einem enormen Potenzial in der regenerativen Medizin zu konvertieren.
Bisher wurde die Verwendung von herkömmlichen mRNA mit niedriger Stabilität und starke Immunogenität assoziiert. So wurden klinische Anwendungen der herkömmlichen mRNAs beschränkt. Aber der Austausch von Cytidin und Uridin durch 5-Methylcytidin und Pseudouridin in der mRNA-Moleküls durch Kariko und Kollegen gerendert mRNA-Molekülen in biologischen Flüssigkeiten stabil und drastisch reduziert Immunaktivierung 7-10, die nun ermöglicht die klinische Anwendbarkeit der modifizierten mRNA.
Verwendung synthetisch hergestellte modifizierte mRNAs können gewünschte Gentranskripten vorübergehend in vivo 11 geliefert werdenoder in vitro, um die Proteinexpression zu induzieren. Die eingeführte mRNA unter physiologischen Bedingungen durch die zelluläre Translationsmaschinerie übersetzt. Aufgrund mangelnder Integration in das Wirtszellgenom Vergleich zu viralen Gentherapie-Vektoren, wird das Risiko einer Onkogenese verhindert 12,13. Somit wird die Therapie mit modifizierten Kunst mRNA besser klinische Akzeptanz in der Zukunft.
Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Herstellung der modifizierten mRNA (Figur 1), die Transfektion von Zellen mit mRNA und die Bewertung der Protein-Expression in transfizierten Zellen.
1. Augmentation von Plasmiden, die gewünschten Codier- DNA-Sequenzen (CDS)
3. Kontroll Schritt: Qualität der PCR Produkt
4. In vitro-Transkription (IVT)
5. Behandlung von gereinigten mRNA mit Antarctic Phosphatase
6. Steuer Schritt: Qualität synthetisierter Modifizierte mRNA
7. Vorbereitung der Zellen für die Transfektion
8. Durchführen von mRNA Transfektion von Zellen
9. Durchflusszytometrische Analysen der eGFP-Expression in Zellen
10. Die Messung der Proteinexpression im Laufe der Zeit
Mit einem pcDNA 3.3 Plasmid, das die CDS der eGFP wurde die Synthese von modifizierten eGFP mRNA hergestellt (Abbildung 1). Nach Einsatz von PCR-Amplifikation und Poly-T-Tailing ist eine klare Bande mit einer Länge von etwa 1.100 bp nachgewiesen (Abbildung 2). Erhöhen der IVT Zeit verstärkte die Ausbeute an mRNA (Figur 3). Nach der IVT wurde ein klares mRNA-Bande mit einer Länge von etwa 1.100 bp nachgewiesen, die auf die Länge des eGFP mRNA produziert werden (Figur 4) entspricht.
Die Funktionalität der erzeugten eGFP mRNA wurde durch Transfektion von HEK293-Zellen getestet. Zu diesem Zweck wurden die Transfektion Komplexe (Lipoplexe) unter Verwendung eines kationischen Lipids Transfektionsreagenz erzeugt. Die Transfektion wurde mit 2 x 10 5 Zellen pro Vertiefung von 12-Well-Platte durchgeführt. Die Herstellung von eGFP in den Zellen nachgewiesen, 24 Stunden nach der Transfektion mittels Fluoreszenzmikroskopie (FiguWieder 5) und Durchflusszytometrie (Abbildung 6).
HEK293-Zellen wurden mit eGFP mRNA transfiziert. eGFP-Expression wurde 1, 2 und 3 Tage nach der Transfektion, die Dauer der Protein-Expression in den Zellen zu bewerten (Figur 7) bestimmt. Nach 24 h wurde die Protein-Expression am höchsten in den Zellen. Der Betrag wurde reduziert 1,6-fach jeden nächsten Tag. Selbst nach 3 Tagen enthielten die Zellen eGFP.
Fig. 1: Übersicht der modifizierten mRNA Produktionsprozess Coding DNA-Sequenzen (CDS) mit bekannten flankierenden Sequenzen werden durch PCR unter Verwendung spezifischer Primer. Das PCR-Produkt wird gereinigt, und die Qualität der erzeugten DNA bestimmt. Die mRNA aus DNA-Produkt unter Verwendung des in vitro Transkriptionsverfahren erzeugt. Das Produkt ist purifie d und mit Phosphatase behandelt, um 5'-Triphosphate zu entfernen. Nach der zusätzlichen Reinigung und Qualitätskontrolle der erzeugten mRNA kann die mRNA Transfektionen durchgeführt werden.
Fig. 2: Analyse der DNA-Produkt nach der PCR-DNA-Leiter und PCR-Produktes wurden auf einem 1% Agarose-Gel laufen gelassen. Eine klare DNA-Bande mit einer Länge von etwa 1.100 bp festgestellt werden sollte.
Fig. 3: Kinetik der in vitro-Transkription zur Erzeugung von eGFP mRNA 1) RNA-Leiter und IVT Produkte nach 2) 0 min, 3) 10 min, 4), 30 min, 5) 180 min, 6) 360 min und 7) DNA-Matrize allein wurden auf einem 1% Agarose-Gel laufen gelassen.
Abbildung 5: Fluoreszenzmikroskopische Analyse von HEK293-Zellen 24 Stunden nach der eGFP mRNA Transfektion. (A) Phasenkontrastbild der Zellen bei einer Vergrßerung von 100X. (B) Fluoreszenzbilder der Zellen bei einer Vergrßerung von 100X.
Abbildung6: Durchflusszytometrische Analysen der eGFP-Expression in HEK293-Zellen 24 Stunden nach der eGFP mRNA Transfektion Die rosa Linie stellt Zellen ohne mRNA Transfektion und die blaue Linie nach eGFP mRNA Transfektion stellt eGFP positiven Zellen.. Nach eGFP mRNA-Transfektion, 93,91% aller gemessenen Zellen sind positiv und die Geo Mittelwert (geometrischer Mittelwert der Fluoreszenzintensität) ist 720,16.
Abbildung 7: Die durchflusszytometrische Analysen der eGFP-Expression in HEK293-Zellen 1, 2 und 3 Tage nach der Transfektion wurden die eGFP mRNA-Protein-Expression am höchsten ist 24 h nach der Transfektion mRNA.. Danach wird der Betrag vermindert 1,6fache täglich (n = 3).
Tabelle 1: Zusammensetzung des PCR-Ansatzes.
Komponente | Endkonzentration | Betrag (ul) |
Forward Primer | 0,7 & mgr; M | 7 |
Reverse Primer | 0,7 & mgr; M | 7 |
5x Q-Lösung | 1x | 20 |
5x HotStar Hifidelity PCR Buffer | 1x | 20 |
Plasmid DNA | 50 ng / 100 ul | Variable |
HotStar Hifidelity DNA Polymerase (2,5 U / ul) | 2,5 U | 1 |
Nuklease-freies Wasser | Variable | |
Gesamtvolumen | 100 |
Tabelle 1: Zusammensetzung des PCR-Ansatzes.
Zykluszahl | Zeit | Temperatur (° C) | |
Anfänglichen Denaturierungsschritt | 1 | 5 min | 95 |
3-Stufen-Radsport | 2-25 | ||
· Denaturierung | 45 sec | 95 | |
· Glühen | 1 min | 55 | |
· Erweiterung | 1 min | 72 | |
Schlussverlängerungsschritt | 26 | 10 min | 72 |
Ende PCR-Zyklen | Unbestimmt | 4 |
Tabelle 2: PCR-Zyklus protocol.
Komponente | Auf Konzentration (mM) | Endkonzentration (mM) | Volumen (ul) |
ATP (von Megascript T7 Kit) | 75 | 7,5 | 4 |
GTP (von Megascript T7 Kit) | 75 | 1,875 | 1 |
Me-CTP (von Trilink) | 100 | 7,5 | 3 |
Pseudo-UTP (von Trilink) | 100 | 7,5 | 3 |
3'-O-Me-m 7 G (5') ppp (5') G RNA-Cap-Struktur analog | 10 | 2,5 | 10 |
Gesamtvolumen | 23 |
Tabelle 3: Zusammensetzung des NTP / cap analoge Mischung.
Komponente | Endkonzentration | Betrag (ul) |
Nuklease-freies Wasser | Variable | |
RNase Inhibitor | 40 U | 1 |
NTP / cap analoge Mischung (aus Schritt 4.3) | 23 | |
PCR-Produkt | 1 & mgr; | Variable |
10x Reaktionspuffer | 1x | 4 |
10x T7 RNA-Polymerase-Enzym-Mix | 1x | 4 |
Gesamtvolumen | 40 |
Tabelle 4: Zusammensetzung der in vitro-Transkription (IVT) Reaktionsgemisch.
Komponente | Betrag (ul) |
Formamid | 3.3 |
37% Formaldehyd | 1 |
MEN Puffer (10x) | 1 |
6x Ladepuffer (mit dem peqGOLD Bereich Mix DNA-Ladder im Lieferumfang enthalten) | 1,7 |
Gesamtvolumen | 7 |
Tabelle 5: Herstellung von Beladungspuffer für die RNA-Gel-Elektrophorese.
Zellkulturmedium und Puffer | |
HEK-293-Zellkulturmedium, | 25 ml FCS, 2,5 ml Penicillin / Streptomycin, 2,5 ml L-GluTamine in 220 ml DMEM High Glucose. Bewahren Sie das Medium bei 4 ° C und verwenden Sie es innerhalb von 2 Wochen. |
TBE-Puffer (10x) | Man löst 0,9 M Tris-Base, 0,9 M Borsäure und 20 mM EDTA in 1 L Wasser (Ampuwa). Der pH-Wert des Puffers 8 ist. |
MEN Puffer (10x) | Auflösen 200 mM MOPS, 50 mM NaOAc, 10 mM EDTA in 1 l Wasser (Ampuwa). Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 7. |
Tabelle 6: Zellkulturmedium und Puffer.
Die mRNA-Therapie hat ein enormes Potenzial im Bereich der regenerativen Medizin, Behandlung von Krankheiten und Impfungen. In diesem Video zeigen wir die Herstellung einer stabilisierten, modifizierten mRNA zur Induktion der Proteinexpression in den Zellen. Unter Verwendung dieses Protokolls kann andere gewünschte mRNA erzeugt werden. Die in vitro Synthese von modifizierten mRNA erlaubt die Transfektion von Zellen mit der gewünschten mRNA die Expression von Zielproteinen zu induzieren. Dadurch wird das gewünschte Protein transient unter physiologischen Bedingungen exprimiert, bis die exogen zuge mRNA vollständig abgebaut.
In diesem Video wurde die Expression von eGFP für 3 Tage nach einer einzigen Transfektion von HEK293-Zellen mit eGFP mRNA nachgewiesen. mRNA-Moleküle kodierenden andere Proteine könnte zu einer kürzeren Proteinexpressionszeit führen. Die Expression des Proteins verringert aufgrund einer Verschlechterung des exogen zuge mRNA. Daher kann die Einschränkung dieser Technik zum some Anwendungen könnte der vorübergehende Induktion der Proteinexpression ist. So, um die Proteinexpression in den Zellen über einen längeren Zeitraum aufrecht zu erhalten, wiederholt Lieferung von mRNA notwendig. Obwohl mRNA-Transfektion hat den Vorteil, nicht-Integration in das Wirtsgenom, die Insertions-Mutagenese und die Entwicklung von Krebs und Leukämie im Vergleich zu viralen Vektoren verhindert, konnte die in vivo Transfektionseffizienz weniger als mit viralen Vektoren sein.
Die erforderliche mRNA Konzentration und Menge des Transfektionsreagenz sollte für jeden anderen Zelltyp 14, der die Zielzellen für die Abgabe von exogenen mRNA, um die fehlenden Proteins produzieren optimiert werden.
Wiederholtes Einfrieren und Auftauen der mRNA sollte vermieden werden, um die Stabilität der erzeugten mRNA erhalten. Daher kann Arbeits Aliquots hergestellt werden. Nach PCR und IVT, sollte nur eine einzige spezifische Bande nachgewiesen werden. Andernfalls wird die Anzahl von PCR-Zyklen Primer Annealing Temperatur und / oder der Menge von Plasmid-DNA sollte optimiert werden, um die spezifische DNA-Produkt für IVT erhalten. Weiterhin kann das IVT Zeit und die Menge an DNA-Templat für die IVT optimiert werden, um mRNA aus einer bestimmten Länge in ausreichenden Mengen zu erhalten.
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Dieses Projekt wurde von dem Europäischen Sozialfonds in Baden-Württemberg, Deutschland finanziert.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cell culture | |||
DMEM, high glucose | PAA | E15-009 | |
FBS | Life Technologies | 10500 | |
Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | 100x |
L-glutamine | PAA | M11-004 | 200 mM |
DPBS without calcium and magnesium | PAA | E15-002 | |
0.04% Trypsin / 0.03% EDTA | Promocell | C-41020 | |
TNS | Promocell | C-41120 | Trypsin Neutralizing Solution, 0.05% trypsin inhibitor in 0.1% BSA |
HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
Consumables | |||
Tissue culture plates, 12-well | Corning | 3512 | |
Cell culture flask (75 cm2) | Corning | 430641 | |
DNase-and RNase-free 1.5 ml sterile microcentrifuge tubes | Eppendorf | 0030 121.589 | Safe-Lock, Biopur |
15 ml conical tubes | greiner bio-one | 188271 | |
PCR clean and sterile epT.I.P.S. dualfilter pipette tips | Eppendorf | 10 µl: 022491202; 100 µl: 022491237; 1,000 µl: 022491253 | |
Cryovial | greiner bio-one | 122279-128 | Cryo.s |
14 ml polypropylene round bottom tube for bacterial culture | BD Falcon | 352059 | |
Plasmid amplification and purification | |||
pcDNA 3.3_eGFP Plasmid | Addgene | 26822 | |
One Shot Top10 chemically component Escherichia coli | Invitrogen | C4040-10 | |
Sterile water (Ampuwa) | Fresenius Kabi | 1636071 | |
LB medium (Luria/Miller) | Carl Roth | X968.1 | Dissolve 25 g L-1 in sterile water. |
LB agar (Luria/Miller) | Carl Roth | X969.1 | Dissolve 40 g L-1 in sterile water. |
Ampicillin Ready Made Solution | Sigma Aldrich | A5354 | 100 mg/ml |
Glycerol | Sigma Aldrich | G2025 | |
QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
mRNA production | |||
HotStar HiFidelity Polymerase Kit | Qiagen | 202602 | |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
MEGAscript T7 Kit | Life Technologies | AM1334 | |
5-Methylcytidine-5´-triphosphate | Trilink | N1014 | 5-Methyl-CTP |
Pseudouridine-5´-triphosphate | Trilink | N1019 | Pseudo-UTP |
3´-O-Me-m7G(5´)ppp(5´)G RNA cap structure analog | New England Biolabs | S1411L | |
RiboLock RNase Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | 40 U/µl |
TURBO DNase | Life Technologies | AM1334 | 2 U/µl (from MEGAscript T7 Kit) |
Antarctic phosphatase | New England Biolabs | MO289S | |
RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
RNaseZap solution | Life Technologies | AM9780 | |
Transfection | |||
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668-019 | Cationic lipid transfection reagent |
Opti-MEM I Reduced Serum Media | Invitrogen | 11058-021 | Improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows a reduction of Fetal Bovine Serum (FBS) supplementation |
Gel electrophoresis | |||
Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
Gelred Nucleic Acid Gel Stain | Biotium | 41003 | 10,000x in water |
peqGOLD Range Mix DNA-Ladder | Peqlab | 25-2210 | |
Flow cytometry analyses | |||
CellFIX (1x) | BD Biosciences | 340181 | 10x concentrate |
Primer for insert amplification and poly (T) tail PCR | |||
Forward Primer (HPLC-grade) 10 µM | Ella Biotech | 5´-TTGGACCCTCGTAC AGAAGCTAATACG-3´ | |
Reverse Primer (HPLC-grade) 10 µM | Ella Biotech | 5´- T120-CTTCCTACT CAGGCTTTATTCAA AGACCA-3´ | |
Equipment | |||
Cell incubator | Binder | CO2 (5%) and O2 (20%) | |
CASY cell counter | Schärfe System | ||
Sterile workbench | BDK Luft-und Reinraumtecknik GmbH | ||
Bacterial incubator | Incutec | ||
Water bath | |||
ScanDrop spectrophotometer | Analytic Jena | ||
PCR thermocycler | Eppendorf | ||
Microcentrifuge | Eppendorf | ||
Vortex | peqlab | ||
Thermomixer | Eppendorf | ||
Gel apparatus for electrophoresis | Bio-Rad | ||
Gel documentation system | Bio-Rad | ||
FACScan System | BD Biosciences | ||
Fluorescence microscope | Nikon | ||
Phase-contrast microscope | Zeiss |
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