金黄色葡萄球菌细胞内感染模型的开发与评价

我们的研究重点是金黄色葡萄球菌感染，目的是建立细胞间感染模型。该模型将为细胞间感染的潜在机制提供有价值的见解，并有助于制定严格的预防和治疗年龄。金黄色葡萄球菌细胞内感染的最新进展是研究感染机制以调节细菌在细胞内的存活和传播，并将加入优化药物和结构修饰以提高更多的治疗效果。

这些研究领域利用细胞培养、细胞新兴测序技术、高燃料氧热、基因编辑技术和其他相关技术来研究细胞中的细菌感染。与传统感染模型相比，我们改进了特定于细胞内感染的实验条件。在用金黄色葡萄球菌单独感染细胞后，然后将细菌感染的细胞接种到小鼠体内以建立细胞内感染。

这种方法通过最大限度地减少游离细菌的干扰来提高效率，确保更准确地保留细胞内感染过程。我们的方法将专注于开发抗体药物，并在未来预防和治疗细菌感染。要制备 6% 淀粉汤，请将牛肉提取物粉、胰蛋白胨和氯化钠以 3 比 10 比 5 的质量比依次加入玻璃容器中。

加入 100 毫升双蒸水并搅拌以溶解成分。在微波炉中加热溶液。然后，加入质量比为 6 的可溶性淀粉，搅拌混合物直至完全溶解。

将肉汤在 121 摄氏度下高压灭菌 30 分钟。消毒后，将肉汤储存在 4 摄氏度下，直到形成糊状。要收集小鼠腹膜巨噬细胞，请用左手抓住小鼠的脖子并控制其尾巴。

然后，翻转鼠标，使其头部向下，腹部朝上。向小鼠腹膜内注射 3 毫升 6% 淀粉汤。注射 72 小时后，处死麻醉的小鼠并用 75% 乙醇消毒。

使用眼科剪刀切开小鼠的腹部，以完全暴露腹膜。通过腹膜内注射将 10 毫升 DMEM 注射到腹腔中。轻轻揉搓腹部 1 分钟，以冲洗空腔。

然后，使用注射器将灌洗的液体收集到 50 毫升离心管中。将灌洗液以 300 G 离心 5 分钟，然后弃去上清液。将细胞沉淀重悬于 10 毫升补充有 10% FBS、青霉素和链霉素的 DMEM 中。

取 10 微升细胞悬液，加入细胞计数器中，对细胞进行计数。用 DMEM FBS 将细胞稀释至 2 倍 10 的浓度，达到每毫升 6 个细胞的幂。将每孔 1 毫升细胞悬液接种到 6 孔板上。

将板在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳中孵育 4 小时。孵育后，去除上清液。用无菌 PBS 洗涤细胞两次，并在相同条件下用每孔 1 毫升 DMEM 培养过夜。

将腹膜巨噬细胞与金黄色葡萄球菌 MRSA-252 孵育 2 小时。去除上清液，用 PBS 洗涤细胞两次。每孔加入 1 毫升含有 100 μg 庆大霉素的 DMEM 完全培养基，并在 37 摄氏度下在 5% 二氧化碳中孵育 2 小时。

孵育后，用 PBS 洗涤细胞 3 次。使用细胞刮刀，将腹膜巨噬细胞收集到 50 毫升离心管中。将样品以 1000 G 离心 5 分钟。

向细胞内 MRSA-252 感染的巨噬细胞中加入每毫升 10 微克溶菌酶，并在 37 摄氏度下孵育 10 分钟。用 PBS 洗涤细胞两次后，将它们重新悬浮在 1 毫升 PBS 中。然后，取出约 20 微升等分试样，加入 0.1% Triton X-100 5 分钟以裂解细胞。

用 PBS 对裂解的细胞悬液进行连续稀释，并将其滴到胰蛋白酶大豆螺旋板上。将板在 37 摄氏度下孵育过夜。第二天，计数细菌菌落以计算腹膜巨噬细胞中的细胞内 MRSA-252 细菌。

将鼠标放在红外理疗灯下，直到尾静脉扩张。将小鼠随机分为四组。将 6 CFU 浮游 MRSA-252 的 3 倍 10 次静脉注射到小鼠的尾静脉中。

24 小时后，处死麻醉的小鼠并用 75% 乙醇彻底消毒。一只手用镊子提起腹部皮肤，另一只手用眼科剪刀切割皮肤。在腹腔中找到肾脏并小心地将它们完全剥离。

将肾脏转移到含有 1 毫升 PBS 的研磨管中，研磨直至没有固体组织残留。将匀浆的组织倒入 Eppendorf 管中。使用 PBS 对组织匀浆进行连续稀释。

将每种稀释液点在单独的三联大豆螺旋板上，并在 37 摄氏度下孵育过夜。第二天对细菌菌落进行计数并分析数据。在优化的吞噬作用条件下成功建立了金黄色葡萄球菌的细胞内感染模型，并扩展了抗生素治疗，一些细菌在巨噬细胞内存活。

当上清液不再含有细菌时，感染耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的巨噬细胞在抗生素处理 2 小时后保留了细胞内细菌。在体内，小鼠的细菌定植试验显示万古霉素消除了细胞外金黄色葡萄球菌，但未能清除细胞内细菌。