猕猴的器官型视网膜外植体培养物

本研究建立的灵长类动物视网膜模型为cGMP-PKG依赖性视网膜恶化的综合机制和治疗开发提供了研究。这种个体非人灵长类动物模型保留了视网膜组织确认和细胞间相互作用，可以更好地模拟体内条件。它还减少了动物的使用，缩短了实验时间。

为研究视网膜发育或变性提供对照实验方法。通过用10毫升5%聚维酮碘洗涤从野生型猕猴中分离的眼球30秒开始制备视网膜外植体。为避免细菌污染，将眼球浸入5%青霉素链霉素PBS溶液中一分钟，然后在10毫升R16培养基中孵育五分钟。

然后将眼球浸入10毫升在37摄氏度下预热的蛋白质Ace-K溶液中，孵育两分钟。在10毫升一对一R16加胎牛血清溶液中进行下一次孵育5分钟。在 10 毫升新鲜 R16 中进行最后一次洗涤。

完成后，将巩膜、角膜、虹膜、晶状体和玻璃体分开。然后用镊子和剪刀从四个侧面剪下视网膜。接下来，使用四毫升的树细刀片在距鼻侧 1.5 毫米、距颞侧 4 毫米和距视神经头上侧和下侧 2 毫米处切割视网膜外植体。

然后使用六毫米的树细刀片切割包含视盘和黄斑的视网膜外植体的中心侧。使用宽移液管，拉出包含视网膜和脉络膜的视网膜外植体，并将其放在插入物的中间，感光器面朝上。将视网膜完全浸没在膜下方板上的一毫升完整培养基中。

培养视网膜外植体，并将它们放入37摄氏度的培养箱中，加湿的5%二氧化碳。对外植体给予适当的药物浓度治疗四天。每个治疗条件至少使用三个外植体，并使用没有药物的外植体作为阳性对照。

对于固定和冷冻切片，用一毫升副形醛处理视网膜外植体45分钟。用一毫升PBS短暂冲洗后，将外植体在10%蔗糖中连续孵育10分钟，20%蔗糖20分钟，30%蔗糖孵育30分钟。均匀切割视网膜外植体，周围有四个象限，中心有六个毫米。

然后将视网膜外植体转移到约1.5×1.5×1.5厘米的锡盒中，用覆盖外植体的最佳切割温度化合物包埋介质。立即将组织切片冷冻在液氮中，并将它们放入20度的冰箱中储存。接下来，将琼脂切成包含组织样品的小块。

将块切成10微米块，并使用软刷将切片放在粘附显微镜载玻片上。然后将切片在 40 摄氏度下干燥 45 分钟，并将它们存放在零下 80 摄氏度直至使用。对于环鸟苷单磷酸或cGMP染色，用液体阻滞笔在干燥的视网膜切片周围画一个疏水环并覆盖样品。

将载玻片浸入200微升0.3%PBS和Triton-X100或PBST中10分钟，然后在室温下在200微升封闭溶液中处理一小时。接下来，将样品载玻片与封闭溶液中制备的 200 μL 一抗在 4 摄氏度下孵育过夜，并用 PBS 冲洗三次 10 分钟。将载玻片在200微升二抗中在室温下孵育一小时。

在PBS洗涤三次10分钟后，用含有DAPI的抗淬灭封片剂覆盖样品，并在成像前在4摄氏度下储存至少30分钟。在室温下将载玻片干燥15分钟，并用液体阻滞笔在视网膜组织标本周围画一个防水屏障环。用40毫升PBS孵育15分钟后，用42毫升0.05摩尔三缓冲液或在37摄氏度下处理切片。

吸出TBS，将样品与6微升蛋白酶K孵育5分钟，并用PBS洗涤载玻片三次，每次5分钟。将载玻片暴露在卓别林中的40毫升乙醇乙酸溶液中。用透明片覆盖，在零下20摄氏度下孵育五分钟。

用TBS清洗载玻片三次，每次五分钟。将载玻片暴露在200至300微升封闭溶液或1%BSA中，并在湿度室中孵育一小时。每张载玻片约130微升TMR红溶液，一小时后，给予两次200微升PBS洗涤，每次五分钟。

将含有一到两滴带有DAPI的抗淬灭封片的盖玻片放在样品上，并在成像前将载玻片在4摄氏度下孵育至少30分钟。用隧道和cGMP顺序染色后，通过调整相机参数进行光学和荧光显微镜检查。使用带有数码相机的软件以20倍放大率从每个部分捕获四个场的图像。

使用DAPI，EGFP和TMR进行z-stack扫描，从视网膜的中心区域获得代表性图片，间隔为1微米，可选为1.251微米。在用不同浓度的PDE6抑制剂Zaprinast处理的视网膜外植体中，与对照组相比，外核层的隧道和cGMP阳性细胞数量显着增加。隧道阳性细胞比例高表明，cGMP活性的增加可能增强巢前诱导的视网膜细胞变性，cGMP积累在感光细胞变性中起一定作用。

外植体制备必须尽快进行。Op动物散射五和任何积累，因为它提高了细胞存活率并增强了散装堆叠系列纤维的地位。在最大程度可见的范围内，玻璃体应用类固醇清洁。

转移视网膜外植体时避免接触视网膜神经纤维层，以防止机械细胞损伤。请注意，为了将视网膜外植体顺利转移到培养插入物中，可以在转移视网膜组织之前预先浸泡宠物以保持湿润。此外，整个过程必须在类固醇气氛中进行，以避免在此过程中受到污染。