Das in dieser Studie etablierte Primaten-Netzhautmodell bietet die Untersuchung des umfassenden Mechanismus und der therapeutischen Entwicklung der cGMP-PKG-abhängigen Netzhautverschlechterung an. Dieses individuelle nichtmenschliche Primatenmodell reserviert die Bestätigung des Netzhautgewebes und interzelluläre Interaktionen, was eine bessere Simulation von In-vivo-Bedingungen ermöglicht. Es reduziert auch den Tiereinsatz und verkürzt die Versuchsdauer.
Bereitstellung eines kontrollexperimentellen Ansatzes zur Untersuchung der Entwicklung oder Degeneration der Netzhaut. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Netzhautexplantate, indem Sie die Augäpfel von Wildtyp-Makaken 30 Sekunden lang mit 10 Millilitern 5%-Povidon-Jod waschen. Um eine bakterielle Kontamination zu vermeiden, tauchen Sie die Augäpfel eine Minute lang in eine 5%ige Penicillin-Streptomycin-PBS-Lösung, bevor Sie sie fünf Minuten lang in 10 Milliliter R16-Medium inkubieren.
Anschließend werden die Augäpfel in 10 Milliliter auf 37 Grad Celsius vorgewärmte Protein-Ace-K-Lösung getaucht und zwei Minuten lang inkubiert. Führen Sie die nächste Inkubation fünf Minuten lang in 10 Millilitern von eins zu eins R16 plus fötaler Kälberserumlösung durch. Eine letzte Wäsche in 10 Millilitern frischem R16 durchführen.
Wenn Sie fertig sind, trennen Sie Sklera, Hornhaut, Iris, Linse und Glaskörper. Schneiden Sie dann die Netzhaut von vier Seiten mit Pinzette und Schere ab. Als nächstes schneiden Sie mit einer vier Milliliter großen Baumfeinen Klinge das Netzhautexplantat in einem Abstand von 1,5 Millimetern von der Nasenseite, vier Millimeter von der Schläfenseite und zwei Millimeter von der oberen und unteren Seite des Sehnervenkopfes ab.
Dann schnitt man mit einer sechs Millimeter dicken baumfeinen Klinge die Mittelseite des Netzhautexplantats ab, das die Papille und die Makula enthält. Ziehen Sie mit einer breiten Pipette das Retina-Explantat mit der Netzhaut und der Aderhaut heraus und legen Sie es mit der Photorezeptorseite nach oben in die Mitte des Einsatzes. Tauchen Sie die Netzhaut vollständig in einen Milliliter des gesamten Mediums auf die Platte unter der Membran.
Kulturen Sie die Netzhautexplanta und legen Sie sie in einen Inkubator mit 37 Grad Celsius und befeuchtetem 5%igem Kohlendioxid. Geben Sie den Explantaten vier Tage lang die entsprechende Behandlung mit der Wirkstoffkonzentration. Verwenden Sie mindestens drei Explantaten pro Behandlungsbedingung und verwenden Sie die Explantate ohne das Medikament als Positivkontrolle.
Zur Fixierung und Kryo-Sektion werden die Netzhautexplanate 45 Minuten lang mit einem Milliliter Paraformaldehyd behandelt. Nach einer kurzen Spülung mit einem Milliliter PBS werden die Explantate nacheinander in 10%iger Saccharose für 10 Minuten, 20%Saccharose für 20 Minuten und 30%30%Saccharose für 30 Minuten inkubiert. Schneiden Sie die Netzhautexplanta gleichmäßig mit vier Quadranten in der Peripherie und sechs Millimetern in der Mitte.
Übertragen Sie dann die Netzhautexplanta in eine Blechdose von etwa 1,5 x 1,5 x 1,5 Zentimetern mit einem optimalen Schneidtemperatur-Einbettungsmedium, das das Explantat bedeckt. Frieren Sie die Gewebeschnitte sofort in flüssigem Stickstoff ein und legen Sie sie zur Aufbewahrung in einen 20-Grad-Kühlschrank. Als nächstes schneiden Sie den Agar in einen kleinen Block mit der Gewebeprobe.
Schneiden Sie die Blöcke in 10-Mikrometer-Blöcke und legen Sie die Abschnitte mit einem weichen Pinsel auf Objektträger. Anschließend trocknen Sie die Abschnitte 45 Minuten lang bei 40 Grad Celsius und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei minus 80 Grad Celsius. Für die zyklische Guanosinmonophosphat- oder cGMP-Färbung ziehen Sie mit einem flüssigen Blocker-Pen einen hydrophoben Ring um die getrockneten Netzhautabschnitte und decken Sie die Proben ab.
Tauchen Sie die Objektträger 10 Minuten lang in 200 Mikroliter 0,3 % PBS und Triton-X100 oder PBST, gefolgt von einer einstündigen Behandlung in 200 Mikroliter Blocklösung bei Raumtemperatur. Anschließend inkubieren Sie den Objektträger über Nacht mit den 200 Mikrolitern Primärantikörper, die in der Blockierungslösung bei vier Grad Celsius hergestellt wurden, und spülen Sie ihn 10 Minuten lang dreimal mit PBS ab. Inkubieren Sie den Objektträger in 200 Mikrolitern Sekundärantikörper für eine Stunde bei Raumtemperatur.
Nach dreimaligem Waschen von PBS für 10 Minuten bedecken Sie die Proben mit einem DAPI-haltigen Antifade-Eindeckmedium und lagern Sie sie vor der Bildgebung mindestens 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius. Trocknen Sie den Objektträger 15 Minuten lang bei Raumtemperatur und ziehen Sie mit einem flüssigen Blocker-Pen einen wasserabweisenden Barrierering um die Netzhautgewebeprobe. Nach 15-minütiger Inkubation mit 40 Millilitern PBS werden die Schnitte mit 42 Millilitern 0,05 molaren Tris-Puffer oder TBS bei 37 Grad Celsius behandelt.
Aspirieren Sie das TBS, inkubieren Sie die Proben fünf Minuten lang mit sechs Mikrolitern Proteinase K und waschen Sie die Objektträger dreimal fünf Minuten lang mit PBS. Setzen Sie die Objektträger 40 Millilitern Ethanolessigsäurelösung im Chaplin aus. Decken Sie es mit einer transparenten Folie ab und inkubieren Sie es fünf Minuten lang bei minus 20 Grad Celsius.
Waschen Sie die Objektträger jedes Mal fünf Minuten lang dreimal mit TBS. Setzen Sie die Objektträger 200 bis 300 Mikrolitern Blockierlösung oder 1 % BSA aus und inkubieren Sie sie eine Stunde lang in einer Feuchtigkeitskammer. Geben Sie bei ca. 130 Mikrolitern TMR-Rotlösung pro Objektträger und nach einer Stunde zwei Waschgänge mit 200 Mikrolitern PBS für jeweils fünf Minuten.
Legen Sie Abdeckobjektträger mit ein bis zwei Tropfen lichtechtem Eindeckmedium mit DAPI über die Proben und inkubieren Sie die Objektträger vor der Bildgebung mindestens 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius. Nach der sequentiellen Färbung mit Tunnel und cGMP wird für die Licht- und Fluoreszenzmikroskopie durch Einstellen der Kameraparameter vorgegangen. Nehmen Sie die Bilder von vier Feldern aus jedem Abschnitt mit der Software mit einer Digitalkamera bei 20-facher Vergrößerung auf.
Erhalten Sie repräsentative Bilder aus den zentralen Bereichen der Netzhaut mit DAPI, EGFP und TMR mit Z-Stack-Scanning und einem Intervall von einem Mikrometer und optional bei 1,251 Mikrometern. Bei den Netzhautexplantaten, die mit unterschiedlichen Konzentrationen des PDE6-Inhibitors Zaprinast behandelt wurden, war die Anzahl der Tunnel- und cGMP-positiven Zellen in der äußeren Kernschicht im Vergleich zur Kontrollgruppe stark erhöht. Der hohe Anteil an Tunnel-positiven Zellen deutet darauf hin, dass die Erhöhung der cGMP-Aktivität die vor dem Nest induzierte Netzhautdegeneration verstärken kann und die cGMP-Akkumulation eine Rolle bei der Photorezeptordegeneration spielt.
Die Explantatvorbereitung muss so schnell wie möglich durchgeführt werden. Op Tier Scatter Fives und jede Akkumulation, weil es das Überleben der Zellen verbessert und den Status der Faser der Bulk-Stack-Serie verbessert. Soweit sichtbar, sollte der Glaskörper mit Steroiden gereinigt werden.
Vermeiden Sie den Kontakt mit den retinalen Nervenfaserschichten bei der Übertragung von Netzhautexplantaten, um eine mechanische Zellverletzung zu vermeiden. Bitte beachten Sie, dass das Haustier vor dem Transfer von Netzhautgewebe in etwas eingeweicht werden kann, um einen reibungslosen Transfer von Netzhautexplantaten in Kultureinsätze zu ermöglichen, um es feucht zu halten. Darüber hinaus muss der gesamte Prozess in der Steroidatmosphäre durchgeführt werden, um eine Kontamination während des Prozesses zu vermeiden.
