视网膜器官诱导系统，用于从人类多能干细胞中提取3D视网膜组织

从 hPSC 到视网膜细胞的诱导过程既复杂又耗时。此优化协议可以生成视网膜组织，具有高可重复性和无成本。本协议的优点是量化EB尺寸和电镀密度，显著提高hPSC视网膜诱导的效率和可重复性。

使用这种方法，所有主要视网膜细胞依次出现并重新概括视网膜发育的主要步骤。它将促进视网膜退行性疾病的疾病建模和细胞治疗。演示程序，我们与袁元冠，博士生，和谢冰冰，从实验室的技术员。

首先准备 50 mL 的 ECM 解决方案，将第三个 50 倍库存溶液的 1 mL 添加到 50 mL 的 DMEM 中。然后，在六井板的每口井中加入 1 mL 的预制 ECM 溶液，并在 37 摄氏度和 5% 的二氧化碳下孵育一小时。根据制造商的指示准备 hPSC 维护介质，并预热至室温 30 分钟。

将一小瓶低温的 hPSC 从液氮罐中倒入 37 摄氏度的水浴中，浸泡 30 秒。使用 75% 酒精喷雾剂仔细消毒，并将其放入生物安全柜中。将细胞悬架从小瓶转移到 15 毫米管。

然后，使用 5 mL 移液器向管中加入 5 mL 预热维护介质滴管，同时轻轻摇动管子以混合 hPSC。以 170 倍 G 离心管，时间为 5 分钟。使用 1 mL 移液器小心地取出大部分超高分子，留下大约 50 微升的超高纳坦，以避免失去细胞。

通过上下管道，用 1 mL 的维护介质重新悬挂颗粒。从预涂层的油井中取出 ECM，并在每口油井中加入 1.5 毫升的维护介质。然后向每口井中分配 0.5 毫升的细胞悬浮。

轻轻摇动盘子，均匀分配 hPSC。将板放在37摄氏度和5%二氧化碳的孵化器中至少24小时，以促进细胞的依从性。每天更改介质，通过 hPSC 的交汇度为 80%。

第 0 天，从六井板的一口井中取出 80% 的汇合细胞，从而启动分化。收集带有 EDTA 分离解决方案的细胞，如文本手稿中所述。取出EDTA溶液，加入含有10微摩尔氟化物的1mL维护介质，以阻止细胞分离。

用 1 mL 移液器收集细胞。将细胞悬浮转移到 100 毫米超低附加的 Petri 盘中，并在盘中加入含有 10 微摩尔氟伐他汀的 9 毫升维护介质。轻轻摇动两次盘，均匀地分配细胞。

然后，在37摄氏度和5%的二氧化碳的孵化器中放入。细胞培养至少24小时后，在显微镜下观察它们。在 15 mL 管中加入 9 mL 的维护介质和 3 mL 的 NIM。

将细胞培养物转移到 15 mL 离心机管中，并将 10 mL 预加热的 NIM 混合物添加到盘中。以 60 倍 G 离心管 3 分钟收集聚合物。然后使用 5 mL 移液器取出超高分子，留下大约 500 微升，以避免丢失细胞。

将混合物的 2 mL 加入管中，并将悬架移回同一个培养皿。轻轻摇动盘，均匀地分配细胞聚集物。然后，将盘子放回孵化器中。

第 5 天，从预涂层的菜肴中取出 ECM，并在每道菜中加入 10 mL 预热 NIM。拿出含有 Ebs 的菜肴，在显微镜下检查 EBS 的质量，确保它们明亮而圆润。在 15 mL 管中收集所有 BB，并允许它们沉淀 5 分钟。

然后，去除大部分超高纳特，留下约2兆L的介质。在计算了 BB 后，以每平方厘米约 2-3 EB 的密度逐滴播种到含有 10 mL NIM 的涂层盘子中。轻轻摇动盘子，均匀地分发EBs，并把它们放在孵化器中至少24小时。

使用钨针或带 1 mL 注射器的针头，在 28 至 35 日机械地分离形态上可识别的光学囊泡，以及相邻的视网膜色素上皮。文化他们在暂停。将50-60个光学囊泡放入每个100毫米的低附件培养皿中，含有15毫升的RDM用于视网膜器官形成。

每 2 到 3 天更改一次介质，直到第 42 天。为了启动视网膜分化，hPSC 被分离成小团块，并在悬浮中培养，从第 1 天起就形成了 EBS。第5天，BB被镀在ECM涂层的培养皿上，细胞逐渐从EB中迁移出来。

在第16天，感应介质被RDM取代，导致神经视网膜域形成并逐渐从盘中突出，以及由RPE细胞包围的细胞形成视囊状结构。在28至35天期间，视网膜器官由神经视网膜组成，附着在RPE球体上。在一边，细胞形成。

随着视网膜分化和规范的进展，hPSC 产生了神经视网膜的亚型，逐渐成层排列，模仿本地人视网膜的建筑特征。视网膜结节细胞最初由视网膜祖体生成，并积聚在神经视网膜的基底侧。有了这个协议，视网膜器官发展成高度成熟的光感受器，既丰富又具有棒和圆锥体。

光受体细胞位于 apal 侧，而单细胞、水平细胞、双极细胞和摩尔胶质细胞都位于神经视网膜的中间层。此协议的要点是创建高质量的 Ebs，并以正确的密度播种。