制备与DNA修复因子络合的核小体核心颗粒用于冷冻电镜结构测定

关于碱基切除修复酶如何在染色质背景下去除DNA病变的结构信息一直很少。这构成了我们对人类疾病病因学机制的理解的重大差距。我们方案的主要优点是，我们使用标准实验室设备优化了样品制备。

这将使该领域的其他生物化学家能够通过技术上可行的冷冻电镜研究来补充他们的生化工作。我们的协议还可用于研究其他因子（包括先驱转录因子）如何参与核小体。这是一个结构信息有限的领域。

在进入冷冻条件之前优化样品制备是推进我们项目的关键，而这最好通过底物设计、结合和交联条件下的标准生化分析来完成。首先，使用特定复合物的最佳缓冲液在冰上孵育NCP和感兴趣的DNA修复因子15分钟。然后，加入戊二醛至终浓度为0.005%混合均匀后，在室温下孵育13分钟。

用一摩尔Tris-CL淬灭至终浓度为20毫摩尔Tris-CL，pH 7.5。然后，浓缩至约50微升，并使用脱盐柱将缓冲液与冷冻缓冲液交换。接下来，确定光密度280和260纳米下的吸光度，如果需要，进一步浓缩，以基于光密度280纳米达到每毫升1.3至3毫克。

准备好透析按钮后，将装有样品的按钮放在聚乙二醇床的顶部，膜朝下。要通过尺寸排阻色谱进行纯化，用60毫升蒸馏水洗涤并平衡尺寸排阻柱，然后以每分钟0.4毫升的速度将80毫升冷冻缓冲液过夜。然后，立即分析峰级分并浓缩含有组蛋白输注蛋白MBP-PolBeta-APE1的级分。

Elizabeth Viverette将展示以下程序，她是来自NIH冷冻电镜核心的学士学位后实习生。打开跳水式冰箱并在加湿器中注入50毫升蒸馏水后，将腔室温度设置为22摄氏度，湿度设置为98%，然后将乙烷杯和液氮杯放入各自的空间支架中。之后，用乙烷盖分配器盖住乙烷杯，小心地将液氮倒在其上，同时在氮气杯中填充液氮。

当液氮水平稳定并达到100%并且温度达到零下180摄氏度时，小心地打开乙烷阀并填充乙烷杯，直到它在透明盖上形成气泡。然后取下乙烷分配器。将两张滤纸放在印迹设备上，并用金属环固定。

转到设置并按照手稿中的说明设置印迹参数，然后选择A-Plunge并单击"确定"。在主屏幕上，单击加载镊子并用网格加载它们，碳应用侧朝向左侧。校准镊子，调整Z轴以确保固体印迹。单击下室并应用三微升复合物。

然后单击印迹A-Plunge，它将旋转网格以从正面印迹并使其冻结。转移后，将网格存放在液氮室的网格盒中。当所有四个网格都已冻结并放置在网格盒中时，将盖子旋转到中性位置，其中所有网格都被盖子覆盖并拧紧螺钉。

在将样品装入显微镜之前，将玻璃化网格放在环上，并在湿度受控的房间内使用液氮下的C形夹将其固定，以避免冰污染。加载显微镜时，将网格插入12槽盒中。将盒式磁带拖入纳米驾驶室胶囊中，然后将其装入自动装载机。

然后，将网格从盒转移到显微镜载物台。通过将载物台摆动 10 度并同时移动 Z 高度，直到在图像中观察到最小的平面偏移，将载物台调整到真心高度。一旦达到以心为中心的高度，通过拍摄网格的 3×3 蒙太奇图像开始成像，其中每个蒙太奇以 62 倍放大倍率拍摄以获得图集。

在选择三个不同大小的正方形并取真心高度后，以 210 倍放大倍率成像。对正方形进行成像后，从正方形内的边缘、中心和中间各选择一个孔。然后，以 2， 600 倍放大倍率对每个孔进行成像。

以36， 000倍放大倍率和7.1秒曝光时间，60帧，1.18像素尺寸和3微米散焦从孔中心拍摄高放大倍率图像。参见具有代表性的筛查图像。为了确定NCP与MBP-PolBeta-APE1形成稳定复合物的比例，进行了电泳迁移率位移测定，结果显示NCP的单移带具有MBP-PolBeta-APE1摩尔过量的五倍。

在较小的体积中，NCP-PolBeta-APE1复合物的组装表明样品过度交联，导致聚集体没有可识别的单个复合物。然而，NCP中的10倍稀释导致聚集显着减少并改善了颗粒稳定性。制备型凝胶和尺寸排阻方法可以结合使用，其中制备型凝胶在NCP含有大量高分子量聚集体时可提高NCP的质量，然后通过尺寸排阻纯化复合物。

结果表明，两种方法都可以独立使用来生成稳定的配合物。此外，从两个网格收集的数据显示了几乎相同的二维类别和三维地图，分辨率约为3.2埃。应首先确定NCP与DNA修复因子的最佳比例，然后将复合物与戊二醛交联，应以比冷冻所需浓度至少稀释10倍的浓度进行。

在获得复合物的冷冻电镜3D图谱后，需要进一步的结构改进以确定如何发现DNA修复因子并确定哪些区域对这些相互作用很重要。