通过质量光度法快速测定抗体抗原亲和力

抗体通常用于实验室技术，其治疗和诊断应用正在迅速扩大。快速准确的抗原-抗体结合特性对于这些应用至关重要。质量光度测量使用极少量的材料快速测量结合亲缘性。

无需贴标签或固定，也可以从同一实验中获得蛋白质寡聚化和纯度信息。该协议不仅可用于研究抗体，还可用于测量分子质量大于50千吨（50千吨）的蛋白质的强蛋白结合。首先使用软尖钳和洗瓶，用蒸馏水、乙醇、蒸馏水、异丙醇和蒸馏水从上到下依次冲洗 24 个 50 毫米的盖玻片。

上次洗涤后，用同一方向的清洁氮气流干燥盖玻片，以避免从钳子中转移污染。如证明，用蒸馏水和乙醇冲洗 24 由 24 毫米盖玻片，然后用干净的氮气流干燥。干燥后，将 24 到 24 毫米的盖玻片放在一块铝箔上，并在盖玻片上放置双面胶带。

然后从铝箔上切出 24 由 24 毫米盖玻片，然后轻轻地将铝箔压在 24 的 50 毫米盖玻片的工作侧。为了准备抗体抗原样本进行亲和力测量，通过0.22微米注射器过滤器过滤至少两毫升PBS，以去除灰尘颗粒和聚集物，并离心机感兴趣的抗体和抗原库存。测量抗体和抗原库存的 280 纳米紫外线吸收度，以确定其实际浓度，并在适当的抗原浓度范围内，以每样本 50 微升的最终体积制备抗体抗原混合物的滴定序列。

然后在室温下孵育抗原-抗体混合物约10分钟，使结合反应达到化学平衡。要通过质量光度测量评估抗体抗原亲和力，在仪器目标上涂抹一滴显微镜浸入油，然后将流室放在显微镜的舞台上。在流室通道的一端添加 10 微升过滤 PBS。

缓冲器将通过毛细管作用进入通道。在数据收集软件的对焦控制选项卡中，使用粗糙的阶段上下移动按钮进行初始调整，单击锐度以查看锐度信号读出。使用精细的上下调整按钮最大化锐度值，然后单击设置焦点和锁定焦点以激活焦点跟踪功能。

干净的幻灯片的图像应具有等于或低于 0.05% 负载 20 微升的第一个抗体抗原样品，如所示，用一小块印迹纸从另一端印迹液体。加载后立即单击记录以获取相当于 100 秒数据的适当帧数。在数据收集期结束时，输入数据的文件名，然后单击"确定"，然后对示例进行采样以保存文件。

要分析大量光度测量数据，请打开感兴趣的文件并单击分析。单击加载以加载校准功能，然后单击文件并保存结果以保存分析的数据。要获取样本中每个物种的相对浓度，请打开拟合的事件。

csv 文件，将 M 列中的数据复制到相应的绘图和分析软件中，并使用绘图统计直方图函数绘制分子质量分布图。双击直方图以打开绘图属性窗口，禁用自动装箱，并选择 2.5 千元大小的 bin 大小。若要创建 bin 中心和计数数据，请单击"应用并转到"。

要将直方图与高斯函数拟合，请选择条柱中心和计数列，然后单击分析峰值和基线多峰拟合菜单功能。双击以指示分布图上的近似峰值位置，然后单击打开 NL 拟合。检查 XC 峰中心的固定复选框，并设置其值，以自由抗体和单抗原-抗体复合物的预期分子质量。

检查共享选项的宽度参数，然后单击"拟合"。高斯分量的拟合峰值高度值表示样品中每个物种的相对浓度。然后使用方程计算每个物种的浓度分数从峰值高度值。

要使用电子表格程序计算平衡常数，请打开分离常数。xlsx 工作表。在此工作表中，可以修改行 1 到 10 中的黄色突出显示单元格值以执行均衡常量计算。

输入以纳米摩尔单位为单位的估计分离常量值到单元格 B1 和 B2 中。如果估计的分离常量值为不知道，请保持单元格 B1 和 B2 中的默认值不变。将纳米摩尔单位的总抗体和总抗原浓度输入细胞D2和E2，并在细胞F2、G2和H2中输入每个物种的计算分数值。执行滴定全局分析时，将适当的数据分数值添加到第 2 行到第 10 行中。在解算器参数窗口中，通过更改可变单元格框，为 设置的目标框选择单元格 B15，选择单元格 B1 到 B2。

选择"执行"选项的最小值按钮并选中"使无约束变量非负"复选框，然后选择 GRG 非线性作为求解方法，然后单击求解。最佳拟合分离常量值将显示在单元格 B1 和 B2 中。平方误差的最终总和将显示在单元格 B15 中。在这个具有代表性的实验中，在固定的25纳米摩尔浓度和0、7.5、15、30、60和120纳米摩尔人α-血栓浓度下，进行了抗人血栓抗体的滴定序列，以获得抗原抗体混合物和抗体样本的分子质量分布。

对高斯成分的最佳拟合峰值高度参数进行规范化，以获得物种浓度分数。然后，浓度分数值适合全球，以获得抗原-抗体结合亲和力。然后可以绘制自由抗体、单抗原抗体复合物和双抗原复合物的实验浓度分数和全球拟合结果。

为了获得准确的KD值，必须仔细选择蛋白质浓度，以填充所有反应物种。我们建议使用一系列抗原浓度制备滴定序列。拟合数据后，可以使用误差投影方法获取拟合误差，但最好重复实验并计算平均结合相关性值的标准偏差。