单粒子冷冻电子显微镜在结构中测定脂质敏感分通道 trpc3 的表达与纯化

该协议使我们能够解决人类TRPC3的结构，一个重要但研究不足的离子通道家族的成员。该技术的主要优点是，在结构和功能研究中，可以应用高效来表达和纯化各种蛋白质。该方法可提供有效的蛋白质表达和纯化系统，用于研究蛋白质生物化学和生物物理，并可应用于多种离子通道和其他膜蛋白。

首先，通过查看病毒生成培养的样本中的病毒的 GFP 荧光来检查相对病毒表达。在一个困惑的底部 Erlenmeyer 培养瓶足够大小， 准备一个 HEK293 哺乳动物细胞悬浮培养物的理想的体积， 浓度为 350 万至 380 万细胞每毫升在表达介质中， 辅以 1% 无菌 FBS.加入8%的P2病毒库存溶液，并在37摄氏度和135 RPM的轨道摇床中孵育。

感染后12至18小时加入10毫摩尔钠，在30摄氏度下孵育，达到最佳蛋白质表达所需的时间。在此之后，离心机在2，880倍重力20分钟收获细胞。每升收获的细胞中大约100毫升TBS中清洗和重新暂停细胞。

在重力2，880倍下再次离心20分钟，并收集细胞颗粒。还要收集小，一毫升细胞颗粒收获在不同的时间点，溶解两个小时在四摄氏度与搅拌在不同的洗涤剂和/或添加剂的存在。通过超离心在23.5万倍重力下和在4摄氏度下10分钟，通过超离心来澄清这些小全细胞溶解样品。

然后，将它们作为 30 微升样品运行在 SEC 色谱柱上，以确定表达式的最佳时间和最佳溶解条件。每升收获的细胞中，将颗粒解冻100毫升缓冲液。一旦细胞解冻，移液器或搅拌它们，以确保溶液是均匀的。

让细胞在摄氏四度时在烧杯中溶解，在冰中浸入两个小时，同时被搅拌棒搅拌。接下来，在重力23.5万倍和摄氏4度的超中心离，清除任何细胞碎片，一小时。HPLC 在 SCC 列上运行 30 微升的上清液样本，以验证蛋白质数量，并通过 GFB 信号输出可视化目标蛋白质。

将含有溶解蛋白的钴亲和树脂结合上清液应用到重力柱上，并收集流经。在 SCC 柱上运行流经的 30 微升样本，以验证蛋白质与树脂是否结合。然后，用10列缓冲液清洗树脂。

在 SCC 柱上运行 30 微升洗涤样本，以检查蛋白质损失。使用缓冲液，对树脂结合的人类TRPC3进行成型。运行在 SSC 柱上稀释 1 到 100 的洗液的 90 微升样品，以检查蛋白质是否已被洗洗，并验证与目标蛋白质大小对应的位置是否存在 GFP 信号。

以 1 到 20 摩尔的比例添加血栓，并将 EDTA 的 10 毫摩尔添加到洗洗样品中。在四摄氏度下孵育三小时。在此之后，将 Eluant 转移到 15 毫升离心过滤管。

在重力2，800倍和4摄氏度的增量下旋转管，将水液浓缩到500微升或更少。在旋转之间上下移液蛋白质溶液，以重新暂停蛋白质，防止过度浓缩。将浓缩物加载到缓冲区中的 SSC 列上。

运行快速蛋白质液相色谱，收集300微升分数。然后，将包含 TRPC3 四面体的峰值分数组合为 UV 吸光信号可视化。并再次浓缩到每毫升至少5毫克的最终浓度。

人类TRPC3是全细胞溶解在各种洗涤剂中，临界微摩尔浓度为0.01至20微摩尔，并在含有缓冲液的DDM/CHS中运行。虽然 DDM/CHS 显示人类 TRPC3 的最高溶解度，但峰值位置看起来太大，不能成为四元人类 TRPC3。整个细胞溶解后，细胞溶解碎片被去除，溶解蛋白被加载到SSC柱上，在含有缓冲液的DDM/CHS洗涤剂中运行在HPLC上，以比较与TRPM4控制相比的不同条件下人类TRPC3的绝对溶解度和峰值体积。

所有不同的洗涤剂溶解TRPC3样品都显示峰值位置在11.9毫升左右，这很可能是太大的，因为人类TRPC3的四元形式分子量小于阳性人体控制TRPM4。然后测试两种不同的溶解和运行包含 DDM/CHS 和 digitonin 的缓冲区。蛋白质在含有数字素的缓冲液中运行，相对于正对照，在合理位置产生最高峰值。

虽然使用25毫升细胞进行小规模纯化，显示了几个宽阔的峰值，但蛋白质通过负染色显示单四边形人类TRPC3通道在2D分类中的特征。然后根据人类TRPC3的生理特性对添加剂进行筛选。EDTA 对将人类 TRPC3 稳定在完整的四元峰值位置具有显著影响，显著增加了低温-EM 显微图中的粒子数量，并降低了背景中的噪声。

最终结果的质量取决于对 HPLC 上的 FSCC 配置文件进行良好的故障排除。在快速完成所有净化步骤时，理想情况下，在一天。结构测定、抗体生成和功能研究，如结合测定或电生理学，可以在此过程后进行。

该技术可以而且已经用于研究其他离子通道和蛋白质系列，并生产纯化蛋白质，用于结构测定以外的应用。应采取适当的预防措施，管理细胞培养生物危害，如在层流罩中工作，穿着防护服，以及妥善处理废物。