一种报告基因检测法，用于分析哺乳动物细胞中内旋微RNA成熟

我们的协议解决了调节性RNA结合蛋白对microRNA生物发生和成熟的影响，直接来自细胞培养物。我们描述的方法可以使用普通的细胞培养试剂进行，并且相对较快。该方法对于研究microRNA的表型效应及其靶标在不同类型的真核细胞中非常重要。

可以使用正常或疾病样细胞。重要的是选择适合转染的细胞系，进行充分的转染和诱导对照，以便通过荧光素酶活性观察靶亲和力的变化。首先，将细胞保持在DMEM中，在100毫米培养皿中补充高葡萄糖，并将细胞在37摄氏度下在含有5%二氧化碳的潮湿受控气氛培养箱中孵育。

要分离贴壁细胞，请将其与胰蛋白酶-EDTA溶液在37摄氏度下孵育三到五分钟。要进行转染，将200纳克DNA和1.25微升转染试剂混合在100微升培养基中，并将转染混合物添加到细胞中。然后，将细胞与转染混合物在37摄氏度下孵育4小时。

然后用含有10%FBS的培养基替换培养基，再孵育24小时，然后加入抗生素进行选择。要将pFLAG-HuR和MT-pFLAG转染到HeLa中，通过将遗传素的浓度从每毫升100微克增加到每毫升1000微克来选择细胞，从而产生稳定的细胞系。然后，使用HuR mRNA的特异性引物通过定量PCR确认过表达。

用40纳克pTK-Renilla转染HeLa-Cre细胞中的质粒，然后pRD miR 17-92，产生HeLa-Cre miR 17-92，并选择每毫升嘌呤霉素1微克。然后，用pTK-Renilla转染HeLa-Cre miR 17-92和pmirGLO RAB1B 3'UTR或pmirGLO分别加扰1B 3'UTR。接下来，选择使用青霉素和链霉素，产生luc RAB1B和luc加扰。

接下来，用pFLAG-HuR或MT-PFLAG转染细胞，如前所述。用HeLa-Cre miR 17-92 luc，HeLa-Cre miR 17-92加扰，HeLa-Cre miR 17-92 HuR和HeLa-Cre miR 1792 HuR锁进行细胞培养，直到达到约80%的汇合度。然后，用一微升多西环素在37摄氏度下诱导30分钟，并将所有没有多西环素的细胞作为对照。

要量化和比较不同的发光强度，请使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒。在开始测定之前，解冻荧光素酶测定溶液并将其置于室温下。接下来，通过将200微升底物与10毫升荧光素酶测定缓冲液二混合来制备混合物Stop和Glo。

然后将10毫升荧光素酶测定缓冲液二混合到琥珀色的荧光素酶测定底物二中，以制备混合物LAR II，并摇匀。之后，将溶液转移到先前确定并避光的15毫升离心管中。接下来，使用Synergy等设备进行发光读数，并将表达的荧光素酶测量为相对光单位，然后将结果导出到电子表格以进行进一步的统计分析。

通过对照 Renilla 对萤火虫荧光素酶活性进行归一化，并将其绘制为图形中的相对光单位，同时对有和没有多西环素诱导的组重复。在HeLa、BCPAP和HEK293T细胞系中证实了转染pFLAG-HuR时HuR的过表达，并且观察到这些细胞中的HuR过表达刺激miR19A的表达。与HeLa-Cre细胞相比，当pRD miR 17-92的miR19A和miR19B表达增加时，RAB1B 3'UTR观察到荧光素酶活性显着降低。

pFLAG-HuR在HeLa细胞中的转染不会改变荧光素酶活性。然而，HuR的过表达，加上多西环素补充剂刺激miR 17-92簇的表达，进一步降低了荧光素酶活性。在确认RNA结合蛋白在microRNA成熟中的作用后，细胞动力学和细胞周期分析对于了解microRNA中蛋白质促进的主要变化非常重要。