用于评估肿瘤细胞中的微RNA水平、功能和相关靶基因的体外协议

获得神经微RNA目标与微RNA功能的相互作用对于了解微RNA如何调节健康状态和患病状态的各种生物过程至关重要。该协议描述了通过策略识别微RNA靶点和功能性微RNA的复制，因为微RNA直接目标的验证具有挑战性。我们的协议可以提供关于单个微RNA的功能和微RNA在癌症治疗中的含义的见解。

计算半最大抑制浓度是一种重要的方法，不仅对于微RNA研究，而且对于其他抗癌药物的疗效评价。我们的协议将有助于新的研究人员，因为我们描述了了解细胞中微RNA水平的基本方法。要开始协议，请用单元格计数器计数单元格。

将细胞板放在96井板中。第二天，准备一组转染混合物，在微RNA对照模拟的几种最终浓度中转染细胞，并模拟微RNA-107。从库存的25微摩尔微RNA控制模仿，或微RNA-107模仿，稀释和添加控制模仿或微RNA-107模仿在减少的血清介质以及微培养管中的转染试剂。

使用微管轻轻混合含寡分的混合物。在细胞培养罩中孵育10分钟后，再次轻轻混合含寡糖的混合物，然后将50微升混合物加入到每个井中。将转染细胞留在细胞培养箱中。

小心地吸进板的每个井中的细胞培养基，并及时将100微升10%的三氯乙酸（TCA）填充到每个井中。将含有 10%TCA 的板在 4 摄氏度下保持一小时。接下来，将盘子淹没在一个带自来水的浴缸里，洗几次。

通过敲击板，直到没有水，从井内去除多余的水，然后擦干板。将 50 微升 0.4% SRB 溶液移入每口井，包括空井。轻轻摇动板，直到 0.4% SRB 溶液均匀地覆盖井底。

然后，孵育板40至60分钟。孵育后，用1%醋酸清洗板，直到未绑定染料被完全冲走。移液100微升10毫摩尔三口基溶液进入相应的井，包括空白井。

将盘子放在摇床上 10 分钟。测量 492 纳米的吸光度。使用 SRB 测定的吸收度值计算每个组的平均吸收率百分比和标准偏差。

通过垂直对齐数据，将原始数据（包括处理浓度、平均吸收度和标准偏差）导入软件。单击"创建图形"选项卡并选择"简单散点错误栏"。选择工作表列作为符号值，然后单击"下一步"。

在"数据格式"面板中，选择 X-Y 对并单击下一步。在"选择数据"面板中选择相应的数据列。单击"完成"以创建绘图。

双击 X 轴可修改轴缩放中的缩放类型。将比例类型从线性更改为日志。将开始和结束范围编号分别修改为 0.01 和 200。

右键单击任何散点图，选择"曲线拟合"，然后转到已定义的子类别用户。选择剂量响应曲线。单击下一个按钮，然后单击"完成"。

转到报表选项卡，然后检查 n、k 和 R 值。运行 PCR，详见随附的文本协议中。然后通过组合反应混合物，包括限制酶Exo1和 Not1在管中加入双消化。

在37摄氏度的水浴中孵育混合物3至4小时。在 1%的加糖凝胶上运行双消化产品。然后在紫外线下切割带子。

从切除频段中净化双消化的PCR产品和荧光素向量。通过制备20微升的结扎反应混合物（包括DNA连接酶），继续将PCR产品与荧光素酶载体连接。将管子短暂离心10至15秒。

使用热循环器在16摄氏度下孵育结扎过夜。第二天，通过将结扎混合物加入含有称职细胞的管中进行转化。轻轻敲按管子，在冰上保持20分钟。

快速、轻轻地将管转移到 42 摄氏度的热块中，30 秒到 1 分钟。热冲击后，将管子放在冰上20分钟。将称职的细胞铺在 LB 阿加板上。

在37摄氏度的培养箱中一夜之间生长称职的细胞。第二天，在含有超纯水的8条管中挑选一个个体菌落并重新分配大肠杆菌，然后重复这一步骤，将大肠杆菌从4个随机选择的菌落重新暂停到8个。将 25 微升大肠杆菌悬浮液转移到另一组 8 条管中。

使用大肠杆菌悬浮液执行菌落 PCR。在24井板中准备荧光素酶测定。在每一个井的500微升细胞培养培养的四个细胞中，将1到2倍的10倍。

经过一夜的孵育，将50纳米的荧光素酶载体转染到细胞中，使用转染试剂进行对照模仿或特定的微RNA模拟。第二天，用磷酸盐缓冲盐水洗两次井内。在测量荧光素酶活性之前，将200微升的解解试剂放入井中，并充分进行细胞解解。

保持板抖至少 15 分钟。将5至10微升的细胞解酶转移到新管中，并加入100微升试剂，然后通过移液立即混合溶液。然后使用光照仪读取萤火虫荧光素酶活性 10 至 15 秒。

在同一管中加入100微升试剂，然后通过移液混合两次。最后，使用光照仪读取 10 到 15 秒的 renilla 荧光素酶活性。RTPCR显示，与HPNE细胞相比，微RNA-107、PANC-1和CAPAN-1细胞显著减少。

与HPNE细胞相比，PANC-1和CAPAN-1细胞的微RNA-301水平显著上升。这项研究中的SRB测定清楚地表明，在微RNA-107模拟转染后，PANC-1细胞的增殖减少。对微RNA-107的11个潜在预测靶点进行筛选，清楚地表明，只有突核素伽马（SNCG）是肿瘤细胞生长的正调节剂，直接与微RNA-107和PANC-1细胞相互作用，表明微RNA-107可以通过调节SNCG表达对PANC-1细胞的增殖产生负性。

使用四氢基实体和 CFSE 的成人细胞增殖检测适用于筛选微RNA模拟等效果，具体取决于细胞类型。基于微RNA的实验验证功能，需要对数据库和目标预测程序进行系统审查，以缩小荧光素分析前候选目标列表。对于微RNA与抗癌药物的结合效率的评价，根据组合指数评价方案计算调整后的IC值是有利的。