הפרוטוקול שלנו מטפל בהשפעות של חלבונים קושרי RNA רגולטוריים על ביוגנזה והתבגרות של מיקרו-רנ"א, היישר מתרביות תאים. השיטה שאנו מתארים יכולה להתבצע עם ריאגנטים נפוצים של תרביות תאים והיא מהירה יחסית. שיטה זו יכולה להיות חשובה כדי לחקור את ההשפעות הפנוטיפיות של מיקרו-רנ"א ומטרותיהם בסוגים שונים של תאים אאוקריוטים.
ניתן להשתמש בתאים רגילים או דמויי מחלה. חשוב לבחור קווי תאים הניתנים לטרנספקציה, לבצע טרנספקציה נאותה ובקרות אינדוקציה על מנת לבחון את השינויים באהדת המטרה באמצעות פעילות לוציפראז. כדי להתחיל, לשמור על התאים ב- DMEM, תוסף גלוקוז גבוה בצלחות פטרי 100 מילימטרים ולדגור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס בחממת אטמוספירה לחה ומבוקרת עם 5% פחמן דו חמצני.
כדי לנתק תאים דבקים, לדגור אותו עם תמיסת טריפסין-EDTA ב 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש עד חמש דקות. כדי לבצע טרנספקציות, מערבבים 200 ננוגרם של דנ"א ו-1.25 מיקרוליטרים של מגיב טרנספקציה ב-100 מיקרוליטרים של מדיום התרבית ומוסיפים את תערובת הטרנספקציה לתאים. לאחר מכן, לדגור על התאים עם תערובות transfection במשך ארבע שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן החליפו את המדיום במדיום המכיל 10% FBS ודגרו במשך 24 שעות נוספות לפני הוספת האנטיביוטיקה לבחירה. כדי להמיר pFLAG-HuR ו- MT-pFLAG לתוך HeLa, בחר תאים על ידי הגדלת הריכוז של גנטיצין מ 100 מיקרוגרם למיליליטר ל 1000 מיקרוגרם למיליליטר, יצירת קווי תאים יציבים. לאחר מכן, אשר ביטוי יתר עם PCR כמותי באמצעות פריימרים ספציפיים עבור HuR mRNA.
טרנספקט את הפלסמידים בתאי HeLa-Cre עם 40 ננוגרם pTK-Renilla, ולאחר מכן pRD miR 17-92, יצירת HeLa-Cre miR 17-92, ובחירה עם מיקרוגרם אחד לכל מיליליטר puromycin. לאחר מכן, טרנספקט HeLa-Cre miR 17-92 עם pTK-Renilla ו- pmirGLO RAB1B 3'UTR או pmirGLO מעורבל 1B 3'UTR בנפרד. לאחר מכן, בחר באמצעות פניצילין וסטרפטומיצין, וכתוצאה מכך דור של luc RAB1B ו luc מעורבל.
לאחר מכן, התמר את התאים עם pFLAG-HuR או MT-PFLAG כפי שהדגימו בעבר. המשך לתרבית תאים עם HeLa-Cre miR 17-92 luc, HeLa-Cre miR 17-92 מקושקש, HeLa-Cre miR 17-92 HuR, ו- HeLa-Cre miR 1792 מנעול HuR עד להגעה לכ-80% מהמפגש. לאחר מכן, לגרום עם מיקרוליטר אחד של doxycycline במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס וגם לשמור על כל התאים ללא doxycycline כמו בקרות לאותה תקופה.
כדי לכמת ולהשוות עוצמות זוהר שונות, השתמש בערכת הבדיקה הכפולה של לוציפראז. לפני תחילת הבדיקה, הפשירו את תמיסות הבדיקה של לוציפראז והשאירו אותן בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להכין את תערובת Stop ו Glo על ידי ערבוב 200 microliters של המצע ב 10 מיליליטר של לוציפראז מבחן מאגר שני.
לאחר מכן ערבבו 10 מיליליטרים של חיץ בדיקת לוציפראז שניים לתוך הערפל הענברי של מצע בדיקת לוציפראז שניים כדי להכין את התערובת, LAR II, ולנער היטב. לאחר מכן, העבר את הפתרונות לצינורות צנטריפוגה של 15 מיליליטר שזוהו בעבר ומוגנים מפני אור. לאחר מכן, בצע את קריאות הזוהר באמצעות ציוד כגון סינרגיה ומדידה המבוטא לוציפראז כיחידות אור יחסיות, ולאחר מכן ייצא את התוצאות לגיליון אלקטרוני לניתוח סטטיסטי נוסף.
לבצע נורמליזציה של פעילות לוציפראז גחלילית על ידי הבקרה רנילה ולהתוות את זה כיחידות אור יחסית בגרפיקה תוך חזרה על קבוצות עם ובלי אינדוקציה של דוקסיציקלין. ביטוי יתר של HuR עם טרנספקציה של pFLAG-HuR אושר בקו התאים HeLa, BCPAP ו- HEK293T, ונצפה כי ביטוי יתר של HuR בתאים אלה מגרה את הביטוי של miR19A. נצפתה ירידה חזקה בפעילות לוציפראז עם RAB1B 3'UTR עם ביטוי מוגבר של miR19A ו-miR19B מ-pRD miR 17-92, בהשוואה לתאי HeLa-Cre.
ההעברה של pFLAG-HuR בתאי HeLa לא שינתה את פעילות הלוציפראז. עם זאת, ביטוי יתר של HuR, יחד עם תוספת דוקסיציקלין הממריצה ביטוי של אשכול miR 17-92, הפחיתו עוד יותר את פעילות לוציפראז. לאחר אישור תפקידו של החלבון קושר ה-RNA בהבשלת מיקרו-רנ"א, קינטיקה של תאים וניתוח מחזור התא יהיו חשובים כדי להבין את השינויים העיקריים שמקדם החלבון במיקרו-רנ"א.
