一种基于报告基因的细胞检测，用于监测剪接效率

该协议描述了使用适应性强的管理报告程序进行监测剪接效率的细胞测定。该检测试剂盒可用于研究与疾病相关的突变在埃克森美孚或剪接位点中的作用，并设计用于治疗，特别是一个颗粒，以提高突变体对五点剪接位点的识别。Hela细胞中的传代吸吸用过的培养基，并在37摄氏度下以含有1毫摩尔EDTA的0.2 5%行程的三毫升孵育细胞三分钟。

在7毫升新鲜DMEM下孵育后，将细胞悬浮液转移到10毫升管中。离心细胞。然后将细胞沉淀重悬于10毫升新鲜DMEM中，并将细胞以20%汇合度接种在新的组织培养皿上，以进行瞬时转染。

用干净的血细胞计数器载玻片计数hela细胞，并制备密度为每毫升2.5倍10至第五个细胞的悬浮液，将一毫升细胞悬浮液接种到12孔板的每个孔中，并在37摄氏度下孵育过夜。第二天吸出用过的培养基，并将800微升新鲜DMEM与血清加入板中。准备转染混合物并涡旋15秒。

然后离心混合物并在室温下孵育五分钟。孵育后，将所有200微升转染混合物加入12孔hela细胞板的一个孔中，以达到每孔1毫升的最终体积，并将板在37摄氏度下孵育48小时。制备的标记反应正在孵育。

通过轻柔涡旋10秒钟重悬25千吨道尔顿分子量截止尺寸排除珠。接下来将600微升重悬的珠子转移到一次性迷你柱中，置于1.5毫升的收集管中，并将珠子库存返回到4摄氏度。离心柱并丢弃流经它们的流量。

然后通过向色谱柱中加入300微升RNA游离水来洗涤珠子两次。第二次洗涤后，将迷你色谱柱转移到新的1.5毫升离心管中，并将激酶反应混合物加入色谱柱中。离心柱并收集通过含有P32标记的寡核苷酸的流动。

将两微克从螺旋细胞中提取的RNA加入200微升微量离心管中，并加入RNA游离水以构成6.55微升的体积。接下来，向每个含有RNA样品的PCR管中加入0.9微升的预混液，并首先在65摄氏度下孵育管5分钟，然后在冰上孵育一分钟。接下来在2.55微升下，将两个预混液，到每个含有RNA的试管和预混料一个，并将试管在室温下孵育10分钟。

孵育后，将管转移到热循环仪中，首先在50摄氏度下孵育60分钟，然后在70摄氏度下孵育15分钟。孵育后，向每个样品中加入10微升2X甲酰胺RNA上样染料，然后通过UIA页面分离片段。珀西DNA合成。

将从转染的hela细胞中提取的2微克RNA加入200微升微米离心管中，并加入RNA游离水以构成低11微升的体积。接下来，加入两微升，每个样品一个预混液，首先在65摄氏度下孵育五分钟，然后在冰上孵育一分钟。接下来，向每个管中加入七微升，预混两个，并将管子在室温下孵育10分钟，然后在50摄氏度下孵育60分钟，在70摄氏度下孵育15分钟。

接下来，对于PCR，稀释C DNA反应以产生每微升100纳克的浓度，并将每个CDNA样品的一微升转移到新的PCR管中。向每个含有CDNA的管中加入10.5微升的预混液，并进行PCR。PCR完成后使用热循环仪。

向每个管中加入12.5微升2X甲酰胺DNA加载染料。将样品在95摄氏度下加热五分钟，然后继续执行UIA页面。将五微升稀释的CDNA移入96孔qpcr板的单个孔中，一式三份。

接下来，向每个孔中加入10微升的实时PCR混合物，用光学膜密封板，然后离心以收集孔底部的反应，然后在收集目标扩增子的阈值定量循环值的同时进行qpcr。在加载标记物和样品之前，用TBE缓冲液冲洗孔以除去沉降的尿素。然后，每孔加载每个样品的10微升，并将凝胶以300至500伏特运行两到三个小时，或直到二甲苯到达底部。

电泳后，从电泳装置中取出玻璃板，并小心地将两个板分开，使凝胶平放在任一玻璃表面上，然后将凝胶转移到滤纸上并用保鲜膜覆盖，使用凝胶干燥器在80摄氏度下真空干燥凝胶30分钟， 然后将干燥的凝胶置于荧光粉成像盒中，在室温下孵育过夜。当在hela细胞中表达时，切片报告程序dup 51 minnijean表达成熟的全长转录本，其中埃克森美孚二号被有效地拼接。五个主要剪接位点突变和dup 51 P将埃克森美孚的两个包涵体从95%降低到30%，导致形成较短的转录本。

dup 51 P与U15A SNRNA的共表达挽救了埃克森美孚的两次剪接，并恢复了全长转录本的形成。相比之下，与野生型U1或U15G变体的共表达对dup 51P拼接没有类似的效果。通过原代扩展检测U15A变异转录本，使用U1 7至26寡核苷酸，其长度为20个核苷酸，碱基对靠近U1 SNRNA第五位置的腺嘌呤。

在仅存在DATP的情况下，U1 7至26允许为内源性野生型U1 SNRNA掺入2至3个核苷酸，产生22或23个核苷酸长产物。对于U15A和U15G变体，在添加产生21核苷酸产物的单个腺苷酸后，延伸终止。在归一化为U2 SNRNA表达后，转染的U1野生型U1 5g和U15A变体在内源性SNRNA上以三到五倍的速度表达。

提取的RNA的质量对于剪接分析至关重要。因此，强烈建议使用不含RNA的水，并用RNA灭活剂对服务进行去污。这里描述的报告系统可以应用于研究U1 SN RNAs在剪接调节中的作用，以使用修饰U1SN RNA进行基因沉默的闪速剪接突变的逆转效应。