路西法黄 - 人类血脑屏障细胞模型中一个健壮的细胞渗透标记

该协议是一种强大的技术，用于确定人类血脑屏障细胞模型中细胞间紧密结的功能完整性。这是一个简单且相当便宜的协议，允许在更短的时间段内计算明显的渗透性，而不是运行更长的动力学测定。该方法还可用于确定脑内皮细胞中与聚合物DNA纳米粒子转运的紧密结的功能完整性。

要开始细胞电镀，请将带微孔膜的组织培养物插入 24 孔培养板。在每个组织培养物插入中加入 400 微升 0.15 毫克每毫升胶原蛋白类型 1。然后在37摄氏度、5%的二氧化碳孵化器中孵育一小时。

轻轻摇动 24 孔板，使胶原蛋白溶液在组织培养物中的微孔膜上甚至扩散。一小时后，取出胶原蛋白溶液，用0.4毫升1X PBS缓冲液轻轻清洗微孔膜。现在，板hCMEC/D3细胞的密度为每平方厘米5万个细胞在细胞插入。

将带有组织培养装置的 24 井板放在培养箱中，以允许细胞附着和增殖。孵育板7天，使细胞达到100%的汇合。每隔一天去除生长介质，将0.5毫升预热新鲜介质转移到组织培养剂中。

重复西印迹的电镀过程，以确定DNA纳米粒子转染的ZO-1表达变化，以及ATP测定，以确定转染细胞中的细胞生存能力。为确定路西法黄的明显渗透性，在播种后的每一天，去除生长介质，并在井底板侧添加1.5毫升预热运输缓冲液。现在，在每个跨井插入的面添加 58.3 微升 20 微摩尔路西法黄色溶液。

保存 50 微升溶液，用于荧光测量。在从一边完全去除残留的PBS缓冲液后，尽快加入路西法黄色溶液，以避免细胞干燥。确保在一边准确体积的路西法黄色溶液。

确保所有刀片中添加相同且准确的路西法黄色溶液体积。快速工作以避免干燥细胞。在旋转板摇床中孵育细胞，温度为 100 RPM 和 37 摄氏度，持续 60 分钟。

然后从每个阴面室中取出 30 微升路西法黄色样品。将 20 微摩尔路西法黄溶液和面样品转移到预标记管中。现在使用传输缓冲器稀释样品十倍。

从每个基底器隔间中取出 500 微升，然后将样品转移到预标记的管中。为标准曲线准备一系列路西法黄色标准。将每个标准标准样品和基底样品的 100 微升添加到黑色 96 井板的每个井中。

使用荧光微孔板读取器测量路西法黄色荧光强度并计算明显的渗透性，如手稿文本中所述。利用栽培时间对路西法黄渗透性的影响，确定紧密结的形成表观动力学。与第一天相比，第七天明显的渗透值显著下降，表明屏障变得更紧。

然后，明显的渗透值稳定下来，直到第10天。这意味着屏障的形成是完整的和功能，导致路西法黄色副细胞传输减少。西印迹用于检测紧结蛋白ZO-1随时间变化。

两个波段表示两个 ZO-1 等构形式。密度测定分析表明，ZO-1的像素值从播种后的第三天增加到第七天，表明紧密结点蛋白ZO-1从三天到第七天持续形成。在播种后的第7天钙消耗处理后，ZO-1的带子几乎无法检测，表明ZO-1在没有钙离子的情况下无法形成。

如结果所示，可以进行ZO-1蛋白的西印，以确定紧密结点蛋白表达水平的变化，补充路西法黄为基础的功能活性数据。我们还发现，人脑内皮细胞中紧密结点的功能活性不受DNA纳米粒子转染的影响。