从水生栖息地分离、繁殖和鉴定具有碳氢化合物代谢特性的细菌种类

该协议概述了从生态栖息地中分离，培养和鉴定碳氢化合物降解微生物。这种方法不需要复杂的仪器，并且可以在标准实验室设置中轻松执行。它也可以很容易地适应研究其他基质。

这种技术可以很容易地转化为各种生态位，并且可以评估不同基质的降解。演示该程序的将是Deepa Sethi，来自Richa Priyadarshini博士实验室的博士生。首先，将500毫升水样收集在来自不同水体部位的五个无菌玻璃瓶中，并测量每个样品的pH值和温度。

然后在无菌条件下通过0.22微米孔径的滤片以100毫升的批次过滤样品。并将纸张放在不同的营养培养基板上，每个盘子放置一张纸。两个小时后，用无菌镊子将纸剥开。

接下来，通过将 100 微升收集的水样加入 900 微升无菌双蒸馏水中来稀释未过滤的水样。继续十倍稀释，直到达到 1 比 1， 000， 000 的稀释比例。通过移液混合，并确保每次稀释的最终体积为一毫升。

将100微升稀释的水样品分别铺在所有生长培养基板上，一式三份。将平板在 30 摄氏度下孵育 24 至 48 小时，具体取决于菌落的生长。要获得分离的菌落，请使用无菌牙签或移液器吸头选择一个菌落。

进行象限条纹，并将平板孵育过夜。第二天，根据菌落的形态特征（如颜色、质地、形状、大小、边缘和海拔）筛选菌落。重新划线菌落以获得纯培养物。

对每种纯培养物进行革兰氏染色后，通过在三毫升适当的生长培养基中接种单个菌落并在30摄氏度下孵育来制备甘油原液。第二天，在冷冻瓶中加入700微升过夜培养物和300微升100%甘油。将小瓶冷冻在零下80摄氏度下长期储存。

从新鲜的盘子中，挑选一个菌落并将其接种在五毫升三联体大豆汤或营养肉汤中。在30摄氏度下培养培养过夜，以200RPM振荡，直到吸光度达到约2。第二天，沉淀细胞。

弃去上清液，用两毫升高压灭菌的盐水洗涤沉淀两次。再次旋转细胞，然后将沉淀重新悬浮在两毫升液态无碳基础培养基或LCFBM中，并测量吸光度。接下来，将两个无菌150毫升锥形瓶标记为A和B，分别用于对照组和实验组。

在烧瓶A中，加入40毫升LCFBM，然后加入终浓度为5毫摩尔的苯乙烯。在烧瓶B中，加入35毫升LCFBM和苯乙烯。然后加入最终吸光度约为0.1的细胞悬液。

用LCFBM将烧瓶B中的体积提高到40毫升后，将两个烧瓶在30摄氏度下以200RPM振荡孵育30天。每五天测量一次每个烧瓶的吸光度，并绘制生长曲线。如果细菌可以利用苯乙烯，则将孵育时间增加多达 45 天。

吸光度的增加表明细菌可以代谢苯乙烯。要从革兰氏阴性细菌中分离基因组DNA，请选择单个菌落并将其接种在无菌试管中的新鲜生长培养基中。在振荡培养箱中孵育过夜后，沉淀1.5毫升生长的培养物。

除去上清液并将沉淀重悬于200微升裂解缓冲液中。然后加入66微升五摩尔氯化钠溶液，搅拌均匀。离心所得混合物后，将透明仰卧移液到新鲜的微量离心管中，并加入等体积的氯仿。

通过多次倒置来混合溶液，直到观察到乳白色溶液。再次旋转试管，并将上清液转移到干净的小瓶中。接下来，加入一毫升冰冷的100%乙醇，倒置混合，直到白色DNA链沉淀出来。

离心沉淀的DNA。弃去上清液。并用一毫升70%乙醇洗涤颗粒。

丢弃洗涤液后，让DNA沉淀在室温下干燥五分钟。干燥后，将沉淀重新悬浮在100微升Tris-EDTA缓冲液中。使用分光光度计测量DNA浓度，并在1%琼脂糖凝胶上运行DNA以评估其质量。

为了鉴定菌株，通过PCR扩增从纯细菌培养物中分离的DNA，使用针对细菌的16S核糖体RNA序列的通用引物。在冰上制备25微升PCR混合物，加入1微升DNA模板，并设置基因扩增的循环条件。PCR后，将五微升样品与一微升五倍DNA上样染料混合。

并在1%琼脂糖凝胶上运行以验证扩增。对于16S核糖体，rNA基因测序，建立与前面描述相同的反应，但体积更大。然后，为了纯化用于Sanger测序的扩增子，将整个样品与DNA上样染料混合，并将其上样到琼脂糖凝胶上以执行凝胶提取方法。

测序完成后，将结果文件转换为更快的格式，并使用NCBI上的BLAST工具检查序列相似性。图中显示了从印度达德里湿地的水样中分离出的细菌菌落。分离的细菌在各自的培养基中单独生长，液体苯乙烯作为碳的唯一来源。

使用儿茶酚降解测定法评估细菌分离株的碳氢化合物降解潜力。此处显示了其中一种分离株的代表性测定。通过在琼脂糖凝胶上可视化小DNA样品来确认基因组DNA的完整性。

16S核糖体rNA基因使用通用引物扩增。构建了一棵系统发育树，以描述从湿地分离的exiguobacterium菌株与已知exiguobacterium物种的相关性。该方案的一个关键步骤是检查被测基板的利用率。

根据生长特性，微生物可能无法立即适应利用被测试的底物，并且可能需要富集过程。该方法侧重于环境样品中可培养的细菌种群。研究人员可以进一步进行实验，例如细菌全基因组测序和代谢分析，这可以为参与碳氢化合物降解的基因和途径提供有价值的见解。