水性抗生素耐药细菌的分离和鉴定及其抗生素耐药基因的分子表征

我们的方法回答了关键问题，例如水样中抗生素耐药细菌的总体负荷是多少？这些细菌的身份是什么，它们携带的抗生素耐药性状和基因是什么？我们方案的优点是，它甚至可以检测出无法在实验室中生长的细菌，这些细菌占水样中细菌总数的很大一部分。

因此，从理论上讲，没有遗漏任何细菌或其耐药性状。这种涉及基于培养和独立于培养的技术的组合技术可以复制和定制从污水、制药或医院废水、临床和非临床环境等获得的任何样品。与Devika一起展示实验程序的是Harshali Shinde和Maitri Mishra，他们都是我实验室的高级研究员。

首先，通过无菌平纹细布过滤水样以去除任何颗粒物，从而无菌处理水样。然后，连续稀释过滤后的水样以进行进一步分析。为了确定总细菌负荷，将100微升适当稀释的过滤水样品放在固化的R2A琼脂平板上并重复，并均匀分布。

将所有样品铺板在 35 至 37 摄氏度下孵育 48 小时。孵育期后，计数菌落并以每毫升菌落形成单位表示总细菌负荷。为了确定抗生素耐药细菌计数，将抗生素分别添加到含有20毫升无菌熔融R2A琼脂的管中，大约在40摄氏度下修饰。

旋转以混合均匀，并在琼脂凝固之前倒入无菌培养皿上。为了进行质量控制并检查抗生素的功效，将100微升细菌悬浮液散布到含有R2A琼脂修饰的抗生素平板上。将板在35至37摄氏度下孵育48小时，然后确定细菌计数。

为了从分离物制备用于PCR的DNA模板，使用无菌牙签，取在培养皿上生长的分离物的单个分离纯菌落。将细菌菌落悬浮在微量离心管中的100微升无菌双蒸水中，并在沸水浴或干浴中在100摄氏度下煮沸10分钟。将悬浮液以10， 000g离心两分钟以沉淀碎片，并将上清液转移到新鲜的无菌微量离心管中以用作粗DNA模板。

为了通过PCR扩增16S rRNA基因的V3区域，请在PCR管中制备40微升反应混合物。将试管放入热模块中，然后在PCR热循环仪中运行适当的程序。为了分离和可视化PCR扩增子，将10微升扩增的PCR产物混合在两微升6x凝胶上样缓冲液中，并将该混合物与100碱基配对DNA分子量标准一起加载到1.5%琼脂糖凝胶的孔中，以估计扩增子的大小。

在 TAE 储液槽缓冲液中以 80 至 100 伏电压对凝胶进行电泳，直到示踪染料运行凝胶的 3/4。然后在紫外透射仪下可视化扩增子带。为了制备接种物，使用无菌环在两毫升不含任何抗生素的Luria-Bertani或LB肉汤中无菌接种单个分离的纯化抗生素耐药菌落，并在37摄氏度下以80rpm孵育过夜。

第二天，将100至150微升过夜生长的培养物加入两毫升新鲜的非选择性LB肉汤中，孵育两至四个小时，直到600纳米处的光密度达到0.4至0.5。使用无菌的0.85%盐水溶液稀释新鲜生长的培养悬浮液，并轻轻混合以均匀分布细胞，以达到相当于0.5麦克法兰标准的培养密度。在稀释后 15 分钟内，将无菌棉签浸入接种物中并去除多余的悬浮液以避免过度接种板。

然后将培养物均匀地铺在准备好的Mueller Hinton琼脂平板上，从顶部开始，从边缘到边缘来回。然后将板旋转 60 度，然后再次开始擦拭。要放置抗生素盘，请使用火焰灭菌的镊子并将抗生素盘无菌转移到接种的琼脂平板上。

轻轻按压圆盘以确保与琼脂完全接触。通过考虑所用抗生素的微生物和平板尺寸，将适当数量的抗生素盘放在琼脂平板上，以避免抑制区重叠。在抗生素盘应用后 15 分钟内，将板倒置并在 37 摄氏度下孵育过夜。

第二天，以毫米为单位测量抑制直径区域，并根据EUCAST给出的断点值进行解释。水样中细菌总载量为3.0 x 10至9 CFU/mL，抗生素耐药细菌载量高。测序的抗生素耐药培养分离株属于肠杆菌科，大多数是大肠杆菌和肺炎克雷伯菌。

此外，还鉴定出罕见的机会性细菌。通过椎间盘扩散法进行的抗生素敏感性测试显示，8种分离株的多重抗生素耐药指数约为0.2，表明耐药性程度高。然而，Comamonas和Arthrobacters对任何测试的抗生素都没有表现出耐药性。

可培养的分离株揭示了编码针对β-内酰胺类、甲氧苄啶和氨基糖苷类药物的因子的抗生素耐药基因的存在。对总细菌多样性的宏基因组DNA分析导致鉴定出50个门，表明细菌多样性高，其中变形杆菌是最主要的门，由α变形杆菌，β变形杆菌和Gammaproteo细菌类组成。在目水平上，伯克霍尔德菌是最普遍的，属于β变形杆菌类。

在一般水平上，假单胞菌，不动杆菌，足杆菌，假杆菌，柠檬习惯菌，黄杆菌和Comomanas是一些丰富的细菌。宏基因组DNA分析还揭示了更多的抗生素抗性基因。在这种方法中，连续稀释步骤至关重要，因为任何错误都可能导致对总CFU和抗生素耐药细菌载量的错误解释。

此外，应仔细测量抑制区的直径，以正确解释分离物是耐药的还是敏感的。使用这些协议，除了水样外，还可以研究任何其他样本，无论是环境、食品还是临床。此外，除了细菌，任何生态系统中的其他微生物种群也可以使用类似的方法进行研究。