胎儿和新生儿小鼠长骨的培养与测量

此方法将骨质培养协议调整为更大的骨骼，允许将直接骨骼操作与复杂的遗传模型相结合，以解决与骨骼发育相关的过程。这种技术允许操作和分析体内不可能的骨骼生长，例如活体成像或直接的物理和药理操作。这种外体培养方法允许具体研究骨骼中基因内嵌的局部影响，将其与治疗对生物体的系统性影响分离。

首先用80%乙醇对妊娠期14.5至18.5小鼠的腹部区域进行消毒，并使用小剪刀打开皮肤和腹部肌肉以进入子宫角。要从腹腔中提取子宫，请取出子宫颈并切开角底。然后，将子宫转移到一个60毫米的培养皿中，里面含有冰冷解剖介质。

在一个生物安全柜之间用剪刀切割麻袋，以分离单个胎儿，并在解剖立体显微镜下将单个麻袋转移到一个新的60毫米的盘中，用新鲜的解剖介质。使用钳子将胎儿与胎盘分离，并清洁胎儿的膜。使用修剪的塑料移液器将身体转移到新的60毫米培养皿中，并在进一步解剖前斩首胚胎。

然后使用钳子去除皮肤，从背部开始，剥到趾趾。使用钳子切近脊柱，将后肢与身体分开。将后肢转移到含有冰冷解剖介质的清洁盘中，在远近股骨的表面软骨和近体头骨之间插入钳子，将头骨与股骨分离。

从近近股骨和钙质骨和腓骨从头骨中去除臀部骨骼。小心地从股骨和头骨中拉出软组织，并使用无菌的一毫升移液器将所有四条腿骨转移到含有新鲜解剖介质的 24 孔板的第一孔中。重要的是要表明，连接骨骼脉搏的软组织被移除。

否则，骨骼将弯曲，不能达到适当的生长。从适当的实验数量中解剖骨骼后，在光显微镜下对每只井中的骨骼进行有时为零的成像，并在每井中用一毫升培养培养介质代替解剖介质，每井格外小心，不要吸气骨。为了观察生长抑制在培养条件下的影响，用500纳米摩尔视网膜酸治疗左头骨，用等量的车辆孵育右头骨作为控制。

然后，在标准细胞培养条件下将板放在细胞培养培养箱中。两天后，用适当的胸腺素模拟治疗骨骼一到两个小时，以评估骨细胞增殖，然后将骨骼转移到4%对甲醛的单个两毫升管10分钟。然后，将骨骼转移到 PBS，在最后一时间点对骨骼进行成像，然后将样本返回至准甲醛，在 4 摄氏度下进行过夜固定。

要测量骨骼的长度和矿化区域，请打开适当的成像软件程序，并考虑到图像的尺度，测量骨骼的总长度和矿化区域。从一端的第一个暗细胞开始测量，直到另一端的最后一个暗细胞。要计算定义为每天平均长度增加的速率，请将骨骼的最终长度和初始长度之间的差值除以培养中的天数。

在这里，显示了培养的头骨和新鲜提取的头骨在等效阶段之间的比较。经过长达两天的培养，达到的大小是可比体内骨生长的软骨和矿化骨。更长的培养期导致培养的骨骼和新鲜提取的骨骼之间的更大差异。

注意，生长与软组织不完全去除的头骨可能导致培养的头骨弯曲。视网膜酸的治疗在治疗两天后就对三叶体生长有强大的影响。虽然在培养两天后，头骨的总长度持续增加，但这种增长与最初长度仅增加约9至29%。

小于体内观察到的骨骼生长增加。事实上，与新提取的同等阶段的骨骼相比，胸腺素模拟标记显示该区域培养后的积极细胞较少。此外，在体外培养的头骨中，骨骼元素的总长度显著增加，而矿化区域几乎没有增加。

除了组织学和分子分析外，还可以在培养后进行清除和三D成像，以描述应用于培养骨骼的治疗的细胞效应。该技术使我们能够解决与组织间通信有关的问题。例如，通过在某种无痛寄生虫实验中从不同的遗传模型中共同培养骨骼。