هذه الطريقة تتكيف بروتوكول ثقافة مشط القدم إلى عظام أكبر، مما يسمح بالتلاعب المباشر في العظام بأن يتم دمجه مع النماذج الوراثية المعقدة لمعالجة العمليات المتعلقة بتطوير العظام. هذه التقنية تسمح بالتلاعب وتحليل نمو العظام غير الممكن في الجسم الحي ، مثل التصوير الحي أو التلاعب البدني والصيدلاني المباشر. تسمح هذه الطريقة السابقة لثقافة الجسم الحي بدراسة محددة للآثار المحلية للدين الوراثي في العظام التي تفصلها عن التأثير الجهازي للعلاج على الكائن الحي.
تبدأ بتعقيم منطقة البطن من الحمل الحملي يوم 14.5 إلى 18.5 الماوس مع 80٪ الإيثانول واستخدام مقص صغير لفتح الجلد وعضلات البطن للوصول إلى قرون الرحم. لاستخراج الرحم من تجويف البطن، وإزالة mesometrium وقطع قاعدة قرون. ثم، نقل الرحم إلى طبق بتري 60 ملليمتر يحتوي على الجليد الباردة تشريح المتوسطة على الجليد.
في مجلس الوزراء السلامة الأحيائية قطع بين أكياس مع مقص لفصل الأجنة الفردية، ونقل كيس الفردية في طبق جديد 60 ملليمتر مع تشريح المتوسطة الطازجة تحت مجهر ستيريو تشريح. استخدم الملاقط لفصل الأجنة عن المشيمة وتنظيف الأجنة من الأغشية. استخدم ماصة بلاستيكية مشذبة لنقل الجسم إلى طبق جديد من 60 ملليمترًا، وقطع رأس الجنين قبل المزيد من التشريح.
ثم استخدام ملاقط لإزالة الجلد، بدءا من الخلف وتقشير إلى أصابع الأقدام. استخدمي الملاقط لقطعها على مقربة من العمود الفقري وفصل الأطراف الخلفية عن الجسم. نقل أطرافه الخلفية إلى طبق نظيف يحتوي على الجليد الباردة تشريح المتوسطة، وإدراج الملاقط بين الغضروف السطحي لعظم الفخذ و شبه الساق لفصل الساق من عظم الفخذ.
إزالة عظام الورك من عظم الفخذ القريب وعظمة كالكانيوس والشظية من الساق. قضم بعناية وسحب الأنسجة الرخوة من عظم الفخذ والقدمين واستخدام ماصة معقمة واحدة ملليلتر لنقل جميع عظام الساق الأربعة إلى البئر الأول من لوحة 24-well التي تحتوي على وسيلة تشريح جديدة. من المهم أن تظهر أن الأنسجة الرخوة التي تربط نبض العظام تتم إزالتها.
خلاف ذلك، فإن العظام ينحني وعدم تحقيق النمو السليم. عندما تم تشريح العظام من العدد التجريبي المناسب من الأجنة، صورة العظام في كل بئر في أوقات صفر تحت مجهر خفيف مع تباين جيد واستبدال وسيط التشريح في كل بئر مع ملليلتر واحد من متوسطة الثقافة في بئر مع مزيد من الحذر لا لpirate العظام. لمراقبة تأثير تثبيط النمو في ظروف الثقافة، علاج الساق اليسرى مع 500 نانومولار حمض الريتينويك واحتضان الساق اليمنى مع حجم مكافئ من السيارة كتحكم.
ثم ضع اللوحة في حاضنة ثقافة الخلية تحت ظروف ثقافة الخلية القياسية. بعد يومين, علاج العظام مع التناظرية thymidine مناسبة لمدة ساعة إلى ساعتين لتقييم انتشار الخلايا العظمية قبل نقل العظام إلى أنابيب ميليلتر الفردية من 4٪ شبه شكلي لمدة 10 دقائق. ثم، نقل العظام إلى برنامج تلفزيوني لتصوير العظام في نقطة الوقت النهائي قبل إعادة العينات إلى شبه شكلي لل التثبيت بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية.
لقياس طول المنطقة معدن العظام، وفتح برنامج التصوير المناسب، ومع الأخذ في الاعتبار حجم الصورة، وقياس طول كل من الطول الكلي للعظم، والمنطقة معدن. بدء القياسات من الخلايا الداكنة الأولى في نهاية واحدة حتى الخلايا المظلمة الأخيرة في الطرف الآخر. لحساب معدل النمو الذي يعرف بأنه متوسط الزيادة في الطول في اليوم الواحد، قم بتقسيم الفرق بين الطول النهائي للعظم والطول الأولي على عدد الأيام في الثقافة.
هنا، تظهر مقارنة بين الساق المستزرعة والساق المستخرجة حديثا في مراحل مماثلة. بعد ما يصل إلى يومين من الثقافة، وحجم ما تحقق هو مماثل لنمو العظام في الجسم الحي لكل من الغضاريف والعظام المعدنية. فترات أطول ثقافة تؤدي إلى اختلافات أكبر بين العظام المستزرعة والعظام المستخرجة حديثا.
لاحظ أن الساق نمت مع إزالة غير مكتملة من الأنسجة الرخوة يمكن أن يؤدي إلى الانحناء من الساق المستزرعة. العلاج بحمض الريتينويك له تأثير قوي على نمو التيبال في وقت مبكر من بعد يومين من العلاج. على الرغم من وجود زيادة ثابتة في الطول الإجمالي لل الساق بعد يومين في الثقافة، وهذا النمو يقابل زيادة تقريبية من تسعة إلى 29٪ فقط من طول الأولي.
أقل من زيادة نمو العظام التي من شأنها أن تكون لاحظت في الجسم الحي. في الواقع، thymidine التناظرية التسمية يظهر عدد أقل من الخلايا الإيجابية في هذه المنطقة بعد الثقافة مقارنة بالعظام المستخرجة حديثا من مرحلة مماثلة. علاوة على ذلك ، في الساق المستزرعة في المختبر ، يزداد الطول الإجمالي للعنصر الهيكلي بشكل كبير ، في حين لا يلاحظ أي زيادة تقريبًا في المنطقة المعدنية.
بالإضافة إلى التحليل النسيجي والجزيئي، يمكن إجراء إزالة الصور والتصوير ثلاثي الأبعاد بعد الثقافة لتوصيف التأثير الخلوي للعلاجات المطبقة على العظام المستزرعة. هذه التقنية تسمح لنا بمعالجة الأسئلة المتعلقة بالاتصالات بين اللجان. على سبيل المثال، من خلال زراعة العظام المشتركة من النماذج الوراثية المختلفة في نوع من تجربة الباروبيسيس الخالية من الألم.
