用于定量研究的小动物脉管系统的快速整装高分辨率成像

该协议引入了一种使用光片荧光显微镜进行定量整体三维血管成像的快速方法。该方法的有效性使用雏鸡胚胎模型的咽弓动脉系统得到了证明，血流动力学 力通过 计算流体动力学量化。

在心血管发育和疾病的小动物模型中，血流的特定主题计算模拟能够对难以通过实验测量的血流动力学指标进行定量评估。计算流体动力学模拟阐明了力学在心血管功能和疾病进展中的关键作用。获取感兴趣血管的高质量体积图像对于形态学测量和流量定量结果的准确性和可重复性至关重要。本研究提出了一种快速、经济高效且易于使用的方法，用于使用光片荧光显微镜对小动物脉管系统进行整装高分辨率成像。改良的 iDISCO+（溶剂透明化器官的免疫标记实现三维成像）光片样品制备方案包括 （1） 用荧光剂标记脉管系统，（2） 保存样品，以及 （3） 使样品透明。与使用免疫组织化学染色的经典 iDISCO+ 不同，作者用 FITC 标记的聚-L-赖氨酸标记血管内皮，这是一种经济实惠的非特异性荧光染料，对光漂白具有很强的抵抗力，这个过程称为“内膜绘画”。快速标记将样品制备时间从大约 4 周缩短到不到 3 天。此外，使用最低危险溶剂肉桂酸乙酯 （ECi） 作为透明化剂和成像溶液，使样品处理更安全，并符合更广泛的成像设施要求。所提出的方案用于获得雏鸡胚胎中心血管系统的高分辨率光片荧光显微镜图像堆栈，范围从第 3 天 （HH18） 到第 8 天 （HH34）。这项研究进一步证明了这种方法通过第 5 天 （HH 26） 雏鸡胚胎的 3D 重建和计算血流动力学建模进行血管定量的适用性。

体积成像对于心血管生理学和疾病的准确研究是必要的。定量成像可生成具有完整体积尺寸的高分辨率图像堆栈。样品必须保存以保持其 体内 形态和管腔体积，并以均匀的高分辨率容量成像。从高分辨率成像堆栈中，用户可以生成高保真三维血管渲染，从而完整显示血管形状、结构和连接性¹。

心血管结构具有复杂的三维解剖特征，通过二维、脱节的镜头检查时无法准确捕捉这些特征。立体镜宽场形态学成像和组织学切片不足以捕捉复杂的三维变化 ^1,2,3。微纳米计算机断层扫描图像是定量小动物体积成像的金标准 ^1,4，但尚未在生物界广泛获得或采用。组织透明化和全器官/小动物显微镜检查的最新创新使整个安装透明化和血管标记技术的定量应用成为可能 ^5,6,7。组织透明化的作用是使组织样品中光的散射均匀化，从而通过降低光散射或吸收的机会来减少光在介质中传播的延迟。高透明度需要严格的组织处理，这可能会影响荧光信号标记的抗原性或亮度⁸。光片显微镜已成为生物学家广泛采用的一种快速、强大的成像工具⁹，其速度比扫描显微镜高出几个数量级，并且能够对 1 cm 以上的样品进行成像。通过光片荧光显微镜 （LSFM），与共聚焦显微镜相比，激光以更高的速度和深度照射样品横截面;因此，该方法需要高样品透明度。

在这里，作者采用了最近的 iDISCO+ 清除方法，将它们与鸡胚动物模型中的 endo-painting¹⁰ 相结合，以展示该方法从心血管发育早期到晚期的疗效。iDISCO（基于溶剂透明化器官的免疫标记三维成像）是一种基于有机溶剂的透明化方法，与基于水性透明化的方法不同，它不会受到溶剂蒸发引起的成像伪影的影响。iDISCO 与 iDISCO+ 的不同之处在于，前者的四氢呋喃脱水步骤 （iDISCO） 被更温和的甲醇脱水取代，然后是脂质提取步骤 （iDISCO+）。iDISCO+ 透明化方法的优势包括对大型成人样品和胚胎进行免疫标记、组织收缩率低和高透明度 ^8,11。重要的是，iDISCO+ 允许生成高分辨率图像堆栈，扩展了传统的生物学免疫标记技术，以获得大器官样本或整个胚胎的信息，而不是像传统组织学那样仅限于对缺乏整个组织水平组织信息的小区域进行采样⁹。iDISCO+ 的缺点包括遗传编码的荧光蛋白没有被保留¹¹。内窥镜画的组织标记方法最初是作为心血管缺陷的高通量筛查引入的，使用 HH31-HH36 鸡胚心脏在左心室心尖灌注 0.5 mg/ml FITC-聚-L-赖氨酸。染料在固定和储存前结合 4 分钟¹⁰.

本研究发现，相同的 FITC-聚-L-赖氨酸浓度可用于更广泛的胚胎 （HH18 - HH34），但发现理想的固定时间是变化的（从 5-10 分钟）以确保标记的血管明亮。如果溶液证明太粘稠而无法标记所有所需的血管，则当前 endo-DISCO 技术的用户可能希望调整染料浓度（一次降低 0.1 mg/mL），但鼓励首先调整固定时间并优化左心室的肌肉收缩在调整染料浓度之前。作者尝试了浓度为 0.1 mg/mL 的内窥镜涂漆，发现虽然染料更容易通过小血管扩散，但在 PFA 灌注时更容易被冲走。作者表明，通过本技术生成的高分辨率成像堆栈对于计算血流动力学建模具有足够的质量。血流路径和相应的血流动力学力，包括压力和壁剪切应力分布，以复杂的局部模式发生，只能通过计算流动模拟来解决 ^1,12。这些生物力学力会影响邻近心血管组织的行为并触发血管适应、生长和重塑¹³。了解局部血流动力学力值有助于阐明心血管功能和疾病发生或进展的机制调节因子²。

实验动物福利办公室将公共卫生服务政策解释为仅在孵化后才适用于雏鸡模型作为“脊椎动物”。这些胚胎同样不受机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的管辖。相关的美国国立卫生研究院常见问题可在以下网址访问：http://grants.nih.gov/grants/olaw/faqs.htm#ApplicabilityofthePHSPolicy。

1. 胚胎采集、标记和固定

1. Fashion 使用微锻造 ^1,12 将 0.75 个内径的玻璃毛细管棒拉入切割的微针中。
   注意：所需的吸头尺寸取决于所需的动物年龄/流速。也可以使用显微解剖钳或剪刀切割微针，但精度大大降低。
2. 将 Tyrode 溶液加热至约 38^°C。
3. 将 FITC 聚-L-赖氨酸固体溶解在 Tyrode 溶液中，制备 0.5 mg/mL 储备液。
   注意：该浓度针对标记雏鸡胚胎动脉进行了优化。其他组织类型的最佳浓度可能会有所不同。额外的储备溶液应储存在 -20 °C。
4. 通过用弯曲的尖剪刀切开胚胎，并使用移液管或抹刀将胚胎转移到装满温热 Tyrode 溶液的 35 毫米培养皿中，从蛋黄中解剖出禽胚胎（从本雏鸡心脏研究的 HH18（第 3 天）到 HH34（第 8 天）。
5. 通过在膜上做微小的 （~0.1 mm） 切口并将它们从胚胎中拉出，用细尖镊子小心地去除包裹胚胎的绒毛膜和尿囊膜以及心脏周围的心包膜。
6. 将胚胎转移到一个新的、干净的培养皿中，培养皿中装满了温暖的 Tyrode 溶液，以保持心脏跳动。
7. 用温热的 Tyrode 溶液填充 5 mL 塑料注射器。修剪 0-20 μL 塑料移液器吸头的宽端，并将其连接到注射器的平头。注射器现已扩展到精细的移液器吸头直径。
8. 通过将一段内径为 0.03 英寸的硅胶管连接到新固定的移液器吸头注射器装置（步骤 1.7）来构建一条“注射线”。将玻璃毛细管微针连接到管路的另一端。
9. 将微针安装到连接到显微作器的显微注射支架上。清除硅胶管和微针上的气泡。
10. 使用显微作器，将针头插入心脏心尖，并通过将 Tyrode 溶液缓慢注入心脏来灌注胚胎 ^1,12。继续灌注胚胎，直到胚胎大部分清除血液。
11. 使用显微作器将针头和注射线从其插入部位拉回并调整针头的方向，以便在准备下一条注射线时不会受到干扰。从针头和注射器上取下硅胶管。
    注意：一些用户可能会发现最好将针头连接到心脏上，在这种情况下，用户应移除针头和注射器之间的硅胶管，同时保持针头就位。
12. 进行内窥镜绘画，用绿色荧光标记血管内皮。
    1. 使用微量移液器，将 20-40 μL FITC 聚-L-赖氨酸储备溶液加载到硅胶管中，注意不要在 FITC 液体屏障之前产生气泡。
    2. 重新连接装满 Tyrode 溶液的注射器，并使用显微作器缓慢注射到心尖，必要时重新插入针头。在 FITC 聚-L-赖氨酸扩散后和任何气泡进入心脏之前拔除针头。
    3. 让 FITC 聚-L-赖氨酸在胚胎中放置 5-10 分钟。
       注意：（可选质量检查）要验证荧光，请使用荧光立体镜或宏距镜拍照。该图片可用于帮助确定胚胎清除完成后的脱水因子。
13. 用 4% 多聚甲醛 （PFA） 填充 5 mL 注射器，并将其连接到硅注射管上，进行第三步注射。
14. 用 4% PFA 灌注胚胎 ^1,12，直到所有心血管结构都处于全体积容量，组织开始变得更加不透明。
15. 将胚胎轻轻加载到 2-5 mL 样品瓶中，该样品瓶中填充了足够的 4% PFA 以覆盖样品。注意不要使胚胎过度变形。
    注：为目标样品选择足够大的样品瓶，以避免压碎样品或变形样品。
16. 用摇床在 4 °C 下孵育胚胎过夜。

2. 胚胎脱水和透明化

1. 小心吸出 4% PFA。
   注意：从这一点开始，避免与胚胎直接接触，以防止组织损伤或变形。
2. 要洗涤胚胎，请将胚胎在室温下在新鲜磷酸盐缓冲溶液 （PBS） 中孵育 30 分钟，同时轻轻摇动。再重复 2 次，总共洗涤 3 次。
3. 开始在通风橱中使胚胎脱水。小心地吸出 PBS，并在室温下以 5 次甲醇孵育的分级系列孵育胚胎，每次孵育 1 小时：20%、40%、60%、80% 和 100% 甲醇浓度。
4. 将胚胎在室温下置于新鲜的 100% 甲醇中过夜。
   注意：（可选停止点）。胚胎可以在 -20 °C 的 100% 甲醇中储存以备后用长达 6 个月。
5. 在通风橱中，开始脂质去除程序。将胚胎在 2：1（体积对体积）DCM：甲醇溶液中在室温下孵育 3 小时，轻轻摇动。
   注意： DCM 有毒，必须在通风橱中处理。使用 DCM 时，请采取额外的预防措施。双层手套可能有助于提供额外的屏障。
6. 将肉桂酸乙酯 （ECi） 从 4 °C 中取出，并在室温下解冻。
7. 在室温下用新鲜的 100% DCM 洗涤胚胎 15 分钟，摇动。重复 100% DCM 洗涤，总共洗涤 2 次。
8. 移出 DCM 并在 100% ECi 中孵育胚胎。将胚胎留在 ECi 中，直到它在大约 1 小时内清除。如有必要，轻轻摇晃试管。
9. （可选验证步骤）使用荧光立体镜或宏观镜检查透明化和血管染色的质量。拍摄胚胎的照片以确定特定阶段/年龄的脱水比例因子。
10. 将清除的胚胎在 4 °C 下储存长达 6 个月，直到准备好成像，保持胚胎避光。

3. 数据的获取

1. 要对胚胎进行成像，请使用光片荧光显微镜。使用强力胶凝胶将光学透明胚胎的头部固定在玻璃毛细管上。
2. 将玻璃毛细管安装到样品架上，用 ECi 填充成像室，然后将胚胎降低到成像室中。
3. 调整参数并执行成像。

4. 定量应用：三维重建和计算流体动力学建模

注意：在这些步骤中，光片生成的高分辨率图像堆栈加载到开源软件 SimVascular¹⁴ 中，用于 3D 解剖重建和计算流体动力学建模。SimVascular 网站上提供了详细的教程（参见 材料表）。重建包括在感兴趣的血管中创建路径线，沿路径线创建 2D 分割，以及将放样分割组合成 3D 实体模型。计算建模包括准备网格化几何结构、定义边界条件和运行仿真。

1. 在 File 下创建一个新的 SVProject，并通过右键单击 Images 然后单击 add/replace image 上传高分辨率光片成像堆栈。
2. 按照软件教程步骤在计算机中重建血管解剖结构。
   1. 通过右键单击 Paths 并选择 create path 来创建路径线。沿感兴趣的容器放置路径标记。对每个感兴趣的容器重复此作。
   2. 对于创建的每条路径线，通过右键单击 Segmentations 并选择 Create Contour Group 来跟踪 2D 血管横截面。选择船舶路径，然后双击 Segmentation 下的船舶名称以开始手动分割。
   3. 分割完所有船只后，右键单击 模型 ，然后选择 创建模型 来创建模型。选择 PolyData 类型，输入模型名称，单击 创建实体模型，然后选择应属于模型的所有分割。
3. 通过运行 SimVascular SVMesher 中内置的 Tetgen 网格划分器来对几何图形进行网格划分。定义最大边尺寸并执行曲面和体积网格划分。
   注：选择可以分辨血管中精细几何细节和局部血流动力学变化的网孔尺寸。从 Estimate a global mesh size （估计全局网格大小 ） 按钮开始。在完成仿真时，可能需要进行网格收敛研究。
4. 使用 SimVascular Solver 设置计算血流模拟。通过右键单击 Simulations 并选择 Create Simulation Job 来创建模拟文件。调整基本参数，并为特定边界条件选择入口和出口 BC。
   1. 调整求解器参数，导航到 Create Files and Run simulation 选项卡，选择网格文件，然后单击 Create Data Files for Simulation。
5. 使用高性能计算工作站或超级计算机启动模拟。

此处介绍的快速全安装高分辨率成像方案（图 1、表 1）产生清晰轮廓的血管腔，如图 2、 图 3 和 图 4 所示，其中鸡胚胎脉管系统内皮是 GFP 荧光的，因此在从早期到成熟心脏发育的整个胚胎阶段以绿色勾勒（图 4).如果样本脉管系统没有明确标记，则找到聚-L-赖氨酸浓度、染料固定时间和心室收缩（如果适用）的正确组合非常重要（参见 图 2 ，了解胚胎在 LSFM 成像前在荧光立体镜或大镜下应该如何观察。通过温暖的 Tyrode 溶液保持心脏跳动，并将胚胎从蛋黄袋中快速解剖，有助于溶液在整个样品/小动物模型中扩散。聚-L-赖氨酸的粘度可以通过储备溶液的浓度来控制。粘度较低的溶液可能有助于整个样品的荧光外显率，但应在 PFA 灌注后验证标记的稳定性。用户可能希望通过增加注射体积并允许增加孵育时间来补偿较低浓度的聚-L-赖氨酸储备液，然后再用 PFA 固定胚胎。

图 5 展示了所提出的方法对 3D 解剖重建和计算建模的适用性。壁面剪切应力值与作者之前基于纳米计算机断层扫描重建的研究一致¹。

图 1：胚胎标记和固定设置（上）和光片显微镜数据采集设置（下）。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2：清除程序前后的胚胎。 代表性的明场和 GFP 通道照亮了经过荧光大镜观察方案步骤 1（透明化前）和 2（透明化后）的样品的胚胎。注意整个胚胎在清除之前如何在 GFP 通道中发光，尤其是在已去除外膜的心脏中。所有所需的脉管系统都在 GFP 清除的胚胎中清楚地标记。比例尺 = 1 毫米。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3：通过 LSFM 获得的心脏流出系统的三维视图和通过该视图获得的相应切片。 PAA- 咽弓动脉，OFT 流出道，DoA - 背主动脉。比例尺 = 0.5 毫米。 请点击此处查看此图的较大版本。

图 4：从第 3 天（HH18 阶段）、第 4 天 （HH24）、第 5 天 （HH26）、第 6 天 （HH29）、第 7 天 （HH31） 和第 8 天 （HH34） 雏鸡胚胎获取的 LSFM 图像堆栈的 z 切片示例。 图像大小表示配备 5 倍检测物镜的瞄准镜的最大（无平铺）视场。V - 心室;A - 中庭;DoA - 背主动脉;PAA - 咽弓动脉。比例尺 = 1 毫米。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 5：第 5 天（HH26 期）主动脉弓的计算机解剖重建和关键血流动力学模拟结果的代表性。 左图：重建的血管解剖模型，显示流出道 （OFT）、咽弓动脉 （PAA） 和背主动脉 （DoA）。中：使用血流模拟获得的收缩峰值血流流线。红色流线主要服务于颅骨区域，而蓝色流线服务于尾部区域。右：使用血流模拟获得的血管壁上峰值收缩壁剪切应力 （WSS） 分布 请单击此处查看此图的较大版本。

表 1：用于快速定量光片成像的样品制备概述。

在 3D 中研究生物学的能力对于准确理解形态复杂性、内部器官结构和血管连接至关重要。准确可靠的 3D 血管图像也是特定主题计算血流动力学模拟的核心，这通常是量化关键血流动力学参数（如壁剪切应力和压力分布）的唯一可靠方法。在这里，作者介绍了一种使用 LSFM 对小动物进行高分辨率 3D 血管成像的快速且可访问的样品制备方法。该方法可靠地生成 HH18（第 3 天）到 HH34（第 8 天）雏鸡胚胎的高分辨率图像堆栈，这代表了心脏发育的关键时期。从 HH24（第 4 天）到 HH34（第 8 天），胚胎总大小从 ~30-550 mm³ 增加，每 24 小时平均生长增加 2 倍，心脏心肌大小从 ~1 mm³（第 4 天）增加到 ~17 mm³（第 8 天）¹⁵。由于胚胎和心血管的快速生长，当前研究的图像以平面内分辨率获得，从 HH18（第 3 天）的 0.61 μm 到 HH34（第 8 天）的 2.28 μm，聚焦咽弓动脉系统时 z 步长范围为 1.92-2.4 μm，捕获整个胚胎时从 1.22 μm （HH18） 到 2.53 μm （HH34），z 步长范围为 1.94-3.5 μm（图 4）。生成的高分辨率图像堆栈适用于计算机血管解剖重建和受试者特异性血流动力学模拟，如 HH26（第 5 天）模型所示，这些模型以 1.30 μm 的平面内分辨率和 1.92 μm 的 z 步长成像¹⁶。与其他全安装技术一样，所提出的方法可用于动物模型，特别是在进行全器官成像时 ^5,6,7。iDISCO+ 技术已应用于新生儿和成年小鼠心脏⁵。

所提出的方法的主要优点在于它使用 FITC 标记的聚-L-赖氨酸进行荧光标记，使用 ECi 进行透明化。聚-L-赖氨酸在生理 pH 值下带正电荷，因此它在通过样品灌注时与血管内皮非特异性结合。该过程可快速可靠地将 FITC 附着在容器壁上，用明亮、稳定的荧光标记它们，该荧光具有很强的抗光漂白性。传统上，包括 LSFM 在内的整体体积显微镜成像需要用免疫组织化学染色标记样品。该程序需要使用昂贵的抗体，并将样品制备时间延长至长达 4 周 ^1,8,9。早期胚胎不表达传统的血管标志物，如弹性蛋白或血管平滑肌细胞，因此更难用特异性抗体靶向。此外，透明化的标本通常在浸没在透明化溶液中时进行成像。经典的 iDISCO+ 透明化程序需要有害化合物二苄醚，这在成像设施中通常是不允许的⁸。ECi 是一种危害最小的化合物，可在实验室环境之外安全处理，并且不太可能损坏光学设备。如果需要，建议的技术可以与免疫染色相结合或多重检测，前提是所选的光谱发射特性允许共表达实验。多重检测可能会增加样品标记和制备时间。

提议的协议有一些局限性。该程序仅适用于处死的胚胎和切除的组织，排除了纵向研究的可能性。FITC 聚-L-赖氨酸内窥镜涂装虽然快速且经济，但需要高度的灵巧性和精度。此外，由于染料不容易穿透组织，它只会标记它可以到达的血管壁，这给研究小毛细血管网络带来了挑战。通过在施用聚-L-赖氨酸时保持心脏跳动并调整注射溶液的粘度/浓度，可以应对此类挑战。染料的非特异性使得难以区分血管类型¹。在注射过程中从脉管系统泄漏的过量 FITC 聚-L-赖氨酸也会与浅表皮肤和膜等非血管组织结合，这可能会干扰成像过程中的照明光片并降低成像质量。用户在注射聚-L-赖氨酸时应保持警惕，以免泄漏。目前的方案使用早期雏鸡胚胎对主要全身动脉进行成像进行了广泛验证。FITC 聚-L-赖氨酸注射液的浓度、体积和固定时间可能需要针对不同的用例进一步优化。

作者没有什么可披露的。

这项工作得到了美国心脏协会职业发展奖、Scientific Interface 的 Burroughs Wellcome Fund 职业奖、Additional Ventures Single Venttricle Research Fund 和 UCSD 医学院显微镜核心（Grant P30 NS047101）的支持。作者感谢 Bobby Thompson 博士对内窥镜绘画的介绍，感谢 UCSD 医学院显微镜核心，以及 Robert Porter （UCSD） 的实验支持。