使用定制的 3D 打印模具生产和分析巴 氏 孢子丝菌生物水泥砖，用于无侧限压缩试验

巴氏孢子丝菌 是一种尿道溶解细菌，可将尿素分解成碳酸盐和铵。碳酸盐与钙结合形成碳酸钙，形成晶格，将周围的颗粒锚定在一起以生产生物水泥。这是使用 3D 打印模具制造适合压缩测试的生物水泥砖的便捷协议。

水泥是全球许多结构中使用的关键建筑材料，从房屋地基到历史古迹和道路。它是世界范围内重要且丰富的材料。然而，传统的水泥生产是人为大气中二氧化碳的主要_{贡献者，导致}温室气体排放和气候变化。微生物诱导方解石沉淀 （MICP） 是一种生物过程，其中 巴氏 孢子丝菌或其他细菌产生与传统水泥一样坚固的水泥材料，但生物水泥是碳中和的。这种生产生物水泥的 MICP 方法是一项很有前途的技术，目前许多公司、国家和研究小组都在积极研究中。此处介绍的协议采用定制设计的、可重复使用的 3D 打印模具对土壤或沙子进行流通式 MICP 处理，生产出符合无侧限压缩测试标准规格的圆柱形砖块。单独的、独立的、带储液罐的模具可以方便地对多个变量和重复进行平行测试。该协议概述了 巴氏葡萄球菌 MICP 反应以及 3D 打印模具的创建、组装和使用 3D 打印模具来生成生物水泥圆柱形砖。

混凝土是世界各地建筑项目的主要建筑材料 ^1,2。一项研究发现，水泥是世界上消耗量第二大的材料，仅次于水³。每年生产近 41 亿吨水泥 ^4,5.传统的水泥生产、加工和应用每年导致全球近 8% 的_CO2 排放量⁶。由于传统水泥生产的高需求和破坏性影响，一种新颖的碳中和粘接方法是全球可持续发展目标的重中之重 7,8,9,10。

生物胶结是利用微生物生产水泥、粘合剂或可用于形成固体表面或结构的物质的过程 ^1,11。最明确的生物胶结过程涉及使用尿酸分解细菌沉淀碳酸钙，将颗粒连接在一起形成硬化的水泥材料^12,13。

在考虑传统水泥的环保替代品时，该替代品还必须满足水泥的强度预期。无侧限压缩试验是一种分析测量方法，用于确定岩石、建筑材料或土壤样品的剪切强度¹⁴。为了进行有效的剪切测试，必须根据行业标准制备样品，其中包括 1：2 的直径高度比和¹⁵ 圆柱形。为了满足这些标准并提高执行 MICP 方案的效率，我们创建了一个定制设计的 3D 打印模具。这些定制设计的模具允许连续 MICP 处理的流通应用和引流。细菌培养和胶合溶液可以很容易地涂在顶部储液器上，然后流经模具，穿过模具底部的网状开口。模具设计为放在烧杯或其他废物收集容器的顶部。模具垂直分为两半，以便于胶合砖脱模。它由固定在模具框架上的八个磁铁固定在一起，并用环氧树脂密封，以防止磁铁因暴露于 MICP 溶液而损坏。两半还包含一个嵌入式凹槽，用于放置橡胶垫圈，这有助于密封模具并防止泄漏。圆柱形模具的内侧有一个凹槽，用于指示沙子/土壤的填充水平，以生产 3 英寸高的砖块;该凹槽上方的空间旨在用作应用处理溶液的蓄水池。构造时，放置在模具内部底部开口上的一块金属丝网可防止沙子或土壤从模具底部掉落。此外，在沙子或土壤的顶部放置一块金属丝网，以帮助均匀分布施加的溶液，并确保形成的砖块顶部平坦，没有任何尖锐的脊线，这可能会影响无侧限的压缩测试结果。

模具使用计算机辅助设计 （CAD） 软件设计，并从 CAD 文件（补充文件 3 和补充文件 4）生成 STL 文件（补充文件 1 和补充文件 2）。此 STL 文件被上传到 3D 打印机程序中，随后进行打印。打印模具后，使用水射流系统去除 3D 打印机生成的支撑材料，留下最终的 3D 打印结构。还包括用于打印夯实装置以帮助压实模具中的沙子/土壤并创建水平顶面的文件。

材料 表中列出了所用试剂、设备和软件的详细信息。

1. 溶液和培养基的制备

1. 脑心输液 （BHI） - 尿素培养基 （1 L）
   1. 使用天平称取 37 g BHI 粉末，并加入 1 L 烧瓶或烧杯中。
   2. 使用天平称取 20 g 尿素，并加入相同的 1 L 烧瓶或装有 BHI 粉末的烧瓶或烧杯中。
      注意：请勿对任何含有尿素的材料进行高压灭菌或添加漂白剂。尿素会分解成氨，氨作为挥发气体可能有害，并且会与漂白剂反应形成有毒的芥子气。根据机构的安全规程，将所有废物作为危险废物处理。
   3. 在装有 BHI 粉末和尿素的 1 L 烧瓶或烧杯中加入 1 L H₂O。
   4. 用 0.45 μM 过滤器混合并过滤，将培养基灭菌到高压灭菌的烧瓶或烧杯中。
2. 胶合溶液 （1 L）
   1. 使用天平称取 20 g 尿素，并加入 1 L 烧瓶或烧杯中。
   2. 使用天平称取 10 g NH₄Cl（氯化铵），并加入同一个含有尿素的 1 L 烧瓶或烧杯中。
      注意：请勿对任何含有氯化铵的材料进行高压灭菌或添加漂白剂。氯化铵会与氨气形成平衡，氨气作为挥发气体可能有害，并且会与漂白剂反应生成有毒的芥子气。根据您所在机构的安全规程，将所有废物作为危险废物处理。
   3. 使用天平称取 49 g CaCl 4.2H₂O（氯化钙），并加入相同的 1 L 烧瓶或装有尿素和氯化铵的烧杯中。
   4. 在装有尿素、氯化铵和氯化钙的 1 L 烧瓶或烧杯中加入 1 L H₂O。
      注：此溶液未灭菌;新鲜准备并在 48 小时内使用。
3. 砖印和准备（在 MICP 处理前几天进行）
   1. 将砖模的 STL 文件（补充文件 1）和夯实装置（补充文件 2）加载到 3D 打印机的相应程序中。
      注意：使用不同的 3D 打印机时，使用的特定程序可能会有所不同。使用适用于您正在使用的打印机的程序。
   2. 打印模具和夯实装置（图 1）。
   3. 根据打印机要求加工模具。
   4. 在模具中的每个适当磁铁槽中放置一个磁铁，确保电荷的位置使模具的两半相互吸引并且不会相互排斥
   5. 适当放置磁铁后，用环氧树脂密封每个磁铁。
   6. 选择两个直径为 1.5 英寸的金属丝网圆圈并放在一边。

2. 积木准备（第 0 天）

注意： 此处提供了准备一块砖的详细信息。

1. 过滤对 150 mL BHI-尿素培养基进行灭菌。高压灭菌 250 mL 培养瓶。
2. 准备 250 mL 胶合溶液;请勿将其放入高压灭菌的 250 mL 培养瓶中。
3. 在装有 BHI 尿素琼脂的培养皿上准备 巴氏血吸 虫分离的条纹培养物，并在 30°C 下孵育 24-48 小时（来自冷冻甘油原液的巴氏血吸 虫）。
4. 巴氏链球菌的发酵剂培养（第 1 天）
   1. 向培养管中加入 1.6 mL BHI-尿素培养基，制备 1.6 mL 起始培养物。
   2. 用第 0 天条纹板中的 1 个菌落接种培养物。
   3. 将发酵剂培养物在摇床 （150 rpm） 中于 30 °C 培养过夜。
5. 培养生长（第 2 天）
   1. 检查发酵剂培养物以确认生长（明显表现为浊度增加）。
   2. 向 250 mL 高压灭菌瓶中加入 40 mL BHI-尿素培养基。将 1.6 mL 发酵剂培养物倒入培养瓶中。在 30 °C 下孵育并摇动 7 小时。
   3. 向培养瓶中再添加 40 mL BHI-尿素培养基。将烧瓶置于 20°C 的摇床中过夜（~16 小时）。
6. 用 巴氏葡萄球菌 进行砖块处理（第 3 天）
   1. 向过夜培养瓶中加入另外 40 mL BHI-尿素培养基，并继续在 20°C 下孵育 巴氏链球菌 。
7. 准备砖模（第 3 天）（见 图 2）。
   1. 将橡胶垫圈放在模具上的适当空间。连接模具的两半，确保垫圈密封且所有磁铁都已连接。
   2. 在圆柱形砖模底部加一圈细丝网，以防止沙子从模具上的孔中落下。
   3. 用沙子或其他材料填充模具，直到模具内部的线，然后牢固地夯实。
   4. 在沙子的顶部放置另一圈金属丝网，以覆盖整个顶面并再次夯实。
   5. 将模具放在废液容器的顶部，以收集流过的液体。
8. 治疗程序（第 3 天）
   1. 将 40 mL 巴氏葡萄球菌 培养物倒在沙子上，让它浸泡。等待 45 分钟。
   2. 将 80 mL 的胶合溶液倒在沙子上。等待 30 分钟。
   3. 将 40 mL 巴氏葡萄球菌 培养物倒在沙子上。等待 30 分钟。
   4. 将 80 mL 的胶合溶液倒在沙子上。等待 30 分钟。
   5. 将 40 mL 巴氏葡萄球菌 培养物倒在沙子上。等待 30 分钟。
   6. 将 80 mL 的胶合溶液倒在沙子上。将砖块单独放置至少 48 小时或直到沙子看起来干燥。
9. 检查最终产品（第 5 天）。
   1. 将模具一分为二并释放磁铁的压力，小心地打开模具。轻轻地从模具中取出砖块。
      注意：如果沙子看起来很湿，模具需要再干燥一两天，然后才能从模具中取出砖块（砖块越干燥，越容易去除）。
   2. 将砖块放在纸巾上继续干燥 3 周，然后再进行压缩测试。
10. 清洁模具（第 5 天）
    1. 从模具中取出砖块后，将垫圈和金属丝网与模具的每一半分开。
    2. 将金属丝网浸泡在 70% 乙醇溶液中 24 小时，然后用水冲洗。可能需要轻微擦洗才能清洁网片。
    3. 用 70% 乙醇冲洗模具，并用软毛刷、海绵或其他清洁设备擦洗至少 3 次;然后用肥皂和水清洁，然后风干
    4. 用 70% 乙醇冲洗垫圈，然后用肥皂和水清洁，然后风干。

3. 压缩测试（第 25 天）

1. 使用无侧限压缩试验分析所有砖块的强度¹⁶.
   1. 确保砖的圆形末端平坦均匀。如果末端不平整，请使用锉刀或其他设备平整表面。
      注意： 如果金属丝网应用正确，砖的末端应该大部分是平坦的。砖的末端尽可能均匀以确保准确测量强度至关重要。
2. 将砖块放入带拉链或密封的塑料袋中，然后将砖块放入塑料袋中，使砖块的平面不被接缝覆盖，从而实现平滑、平坦的覆盖。
3. 将砖块放在下部装载板上。在砖块顶部放置一个平坦且均匀的装载板。
4. 通过无侧限压缩试验机对砖施加约 1 磅的压力。
5. 去皮数字读数。
6. 根据机器规格连续施加增加的负载，直到砖的结构完全失效。
7. 记录每块砖的最大承重载荷。执行所需的统计分析以评估结果。

3D 打印模具的结构如图 1 和图 2 所示。积极的结果应该被视为砖块在从模具中取出时保持其形状，并且在干燥 3 周后，看起来是一个坚固的结构，可以很容易地处理，并且触摸造成的材料损失最小。如果砖块不坚固，并且因触摸或移动而碎裂或造成重大材料损失，则可能是培养基或培养物制备中存在错误。正负砖结果的示例如图 3 所示。

如图 4 所示，模具用于同时测试两种不同的基材：粗砂和细砂。使用此处概述的巴氏葡萄球菌方案制作了总共四块使用粗砂的砖和四块使用细沙的砖，并进行了无侧限的压缩测试。先前记录的使用 S. pasteurii 对生物胶结土进行无侧限抗压强度的结果表明，范围为 48-12,400 kPa，具体取决于土壤或沙子类型以及 S. pasteurii 的脲酶活性 ¹⁷。粗砂砖的平均最大载荷为 95.125 PSI （655 kPa），而细砂砖承受的平均最大载荷为 49.625 PSI （321.46 kPa）。根据需要轻松 3D 打印任意数量的模具的能力允许同时测试所有变量，从而最大限度地减少潜在变化。

图 1：砖模。 此图说明了 3D 打印模具的 3D 打印图。模具的每一半都是单独打印的。模具加工后，将磁铁放置在指定的 8 个位置并用环氧树脂密封。模具的内表面包含两个凹陷区域，两半在其中连接。橡胶垫片材料经过切割以匹配这些凹陷区域，以确保模具的防水密封。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2：模具的构造、处理和脱模。 下图概述了组装模具和创建砖块样品的分步过程：第 1 步：根据文件规格切割垫圈材料组装模具，将 16 个磁铁中的每一个插入指定的孔中并用环氧树脂密封。第 2 步：将垫圈放入模具中适当的凹痕中。第 3 步：将模具的两半连接起来。第 4 步：（a） 从模具顶部插入一块圆形金属丝网，以覆盖底孔，防止砂子从中落下;（b） 将沙子或土壤添加到模具中，直至模具内部标记的填充线;（c） 在沙子或土壤上放置第二块圆形金属丝网;（d） 使用夯实装置用力压制金属丝网的顶层，确保砖块的顶层平整均匀。第 5 步：将装有沙子的模具放在烧杯或其他容器的顶部，以收集流出液。第 6 步：按照方案进行治疗。第 7 步：干燥期后，将模具侧放，小心地将模具的上半部分与下半部分分开。如有必要，让砖在模具的下半部分继续干燥，直到它变得足够坚固，可以整块地提起。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3：遵循 brick 协议的预期结果。 （A） 显示了预期的积极结果，其特征是清晰的边缘和坚固的圆柱形结构。（B） 显示了预期的负面结果，其特征是崩溃和缺乏结构稳定性。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 4：压缩测试。 该图显示了使用 3D 打印模具同时生产的 8 块砖的无侧限压缩测试结果。粗砂的平均强度为 95.125 PSI，而细砂的平均强度为 49.625 PSI。误差线表示标准差。执行学生 t 检验 以计算用于统计分析的 p 值。用粗基板制成的砖明显比用细粒径基板制成的砖更坚固（p 值< 0.005）。所有砖块均用同一批次的溶液处理，并在相同条件下干燥，以尽量减少实验不一致。 请单击此处查看此图的较大版本。

补充文件 1：模具的 STL 文件。 此文件包含用于模具设计的 3D 打印 STL 文件。 请点击此处下载此文件。

补充文件 2：用于夯实装置的 STL 文件。 此文件包括夯实装置的 3D 打印 STL 文件。 请点击此处下载此文件。

补充文件 3：模具 CAD 文件。 此文件提供用于模具设计的 CAD 文件。 请点击此处下载此文件。

补充文件 4：夯实装置 CAD 文件。 该文件包含用于夯实装置设计的 CAD 文件。 请点击此处下载此文件。

关键步骤
该生物胶结协议利用巴氏链球菌 MICP 生产适用于无限制压缩测试的生物胶结圆柱形砖。无侧限压缩测试的最关键因素之一是样品的形状和结构。确保圆筒产品的顶部和底部平坦，砖的高度尽可能接近 3 英寸;略高于 3 英寸的高度标记比低于 3 英寸要好。由于沙子/土壤的沉降，在进行处理时会损失一点高度;因此，建议在初始处理之前稍微填充模具。在处理之前放置在沙子/土壤顶部的金属丝网圈有助于分布所应用的溶液并形成更平坦的表面¹⁶。彻底清洁模具、网眼和垫圈对于最大限度地降低未来砖块的交叉污染风险至关重要。清洁网片或使用新网片也很重要，因为随着时间的推移，它会变成生物胶结/堵塞，如果不清洁或更换，会降低流出率^13,17。

修改/故障排除

模具
可以使用许多其他打印设备和材料来满足研究人员的需求。还可以修改 CAD 文件以满足不同的需求，并生成更大、更小或替代的模具形状。此外，可以使用任何垫圈材料或磁铁;只需确保它们符合 CAD 文件中的尺寸或修改 CAD 文件以满足不同的需求。金属丝网也可以换成不同的网眼或可能的滤纸;确保孔隙足够小，以防止颗粒物落下。如果颗粒从底部开口落下，这通常是由于金属丝网放置不当以及网眼和模具之间存在间隙造成的。检查网格的位置。如果应用的解决方案从模具侧面有大量泄漏，则可能是垫圈材料有问题。切割过程中可能存在问题，或者垫圈可能放错了位置。如果调整位置不能解决问题，则可能需要切割新的垫圈。如果在模具中观察到交叉污染，则可能需要将模具、网或垫圈浸泡在 70% 乙醇溶液中，或用新的模具、网或垫圈替换它们^14,15。

MICP
MICP 应用过程可以修改以满足不同的需求，即更换培养瓶/烧杯/等。培养过程不需要所描述的平板方法;此处可应用来自甘油原液的液体培养物或任何其他培养方法¹².可以使用自动移液器或从量筒中倒入或任何其他允许控制体积的方法对土壤样品进行处理。有时，细菌培养物可能无法正常生长;这可以通过孵化后没有浑浊来注意到。如果发生这种情况，请使用新的菌落或发酵剂重新开始培养过程。建议进行定量步骤，即测量 OD 600 或菌落计数，以控制和记录应用于每块砖¹⁶ 的细菌浓度。

局限性
这是一个漫长的过程，需要几天时间，并且需要在开始之前做好准备。一旦第 1 天协议开始，就没有机会暂停实验。

意义
该协议概述了一种生产适用于无侧限抗压强度测试的圆柱形生物水泥砖的方法，提供了一种能够测试岩土工程应用的生物胶结技术的方法^13,17。

未来的应用
该方案的重要性在于它能够高效地优化生物胶结方案，同时测试过程中的多个变量。可重复使用的模具允许形成用于无限制压缩测试的特定尺寸的圆柱形砖块，模具顶部的储液器允许 MICP 溶液批量应用，而不是在等待它们穿过模具中的材料时一点一点地缓慢应用解决方案。可以打印和并行使用任意数量的单个模具，从而可以轻松比较不同的变量，例如胶合溶液化学成分的变化或不同微生物的使用。由于模具设计为位于容器顶部以收集流通废物，因此可以测量和评估流通量的细菌计数、pH 值、离子含量或任何其他测试变量。一些研究，例如对基因工程改造表达脲酶的大肠 杆菌 的 MICP 能力的评估，通过测量钙消耗来测量沉淀动力学，重点是直接比较不同菌株的细菌或不同的质粒构建体;该协议非常适合这种类型的评估或优化研究¹⁸。

作者声明没有利益冲突。本手稿已获准公开发布。PA 编号：USAFA-DF-2024-777。本文中表达的观点是作者的观点，并不一定代表美国政府、国防部或空军部的官方立场或政策。

本材料基于美国空军学院和空军研究实验室赞助的研究，协议编号为 FA7000-24-2-0005 （MG）。美国政府有权为政府目的复制和分发重印本，即使其上有任何版权标记。