使用分体路西酶测定系统识别 HBx-DDB1 相互作用的抑制剂

在这里，我们提出了一种使用裂解荧光素酶检测系统来抑制HBx-DDB1相互作用的抗乙型肝炎病毒药物的方法。该系统易于检测蛋白质-蛋白质相互作用，适用于识别此类相互作用的抑制剂。

迫切需要新的治疗乙型肝炎病毒（HBV）感染的治疗方法。虽然目前可用的核细胞（t）ide类比能有效抑制病毒复制，但它们对从病毒共价闭环DNA（cccDNA）转录的病毒蛋白的表达没有直接影响。由于高病毒抗原负荷可能在这个慢性和HBV相关的致癌作用，HBV治疗的目标是根除病毒蛋白。HBV调节蛋白X（HBx）与宿主DNA损伤结合蛋白1（DDB1）蛋白结合，降解染色体5/6（Smc5/6）的结构维持，导致从cccDNA激活病毒转录。在这里，使用裂化荧光素酶补充测定系统，我们提出了一个全面的化合物筛选系统，以识别HBx-DDB1相互作用的抑制剂。我们的协议能够轻松检测活细胞内的相互作用动力学。这项技术可能成为发现治疗HBV感染的新治疗剂的关键测定方法。

乙型肝炎病毒（HBV）感染是全世界一个重大的公共卫生问题，每年估计有2.4亿人长期感染乙肝病毒，9万人死于感染并发症，包括肝硬化和肝细胞癌^{（HCC）1。}虽然目前抗HBV治疗剂，核细胞（t）类比，足以抑制病毒逆转录，但它们很少实现病毒蛋白的消除，这是长期的临床目标。它们对病毒蛋白消除的不良影响是因为他们对肝细胞核²中表皮病毒共价闭合环DNA（cccDNA）小染色体的病毒转录缺乏直接影响。

HBV转录由HBV调节X（HBx）蛋白³激活。最近的研究表明，HBx通过劫持DDB1-CUL4-ROC1 E3泛素结合酶复合^{物4，5，6，}降解染色体5/6（Smc5/6）的结构维持，这是阻止HBV转录从cccDNA的宿主限制因子。因此，促进来自cccDNA的病毒转录的关键步骤被认为是HBx-DDB1相互作用。能够抑制HBx和DDB1之间结合的化合物可以阻断病毒转录，事实上，硝基氧烷通过实验室⁷开发的筛选系统被确定为HBx-DDB1相互作用的抑制剂。

在这里，我们介绍我们方便的筛选系统，用于识别HBx-DDB1相互作用的抑制剂，它利用裂性荧光素酶补充测定^7，8。裂化荧光素酶亚单位与HBx和DDB1融合，HBx-DDB1相互作用使亚单位接近，形成产生明亮发光信号的功能酶。由于亚单位之间的相互作用是可逆的，该系统可以检测迅速分离的HBx-DDB1蛋白（图1）。利用该系统，可以很容易地筛选大型化合物库，从而发现能够有效抑制HBx-DDB1相互作用的新型化合物。

注:图1A显示了裂解荧光素酶测定的示意图表示，如图1B所示。图1B概述了测定过程。 相互作用动力学可以实时测量，无需细胞分变。

1. 细胞制备

1. 在Dulbeco的改性Eagle培养基（DMEM）中保持培养的HEK293T细胞，辅以10%v/v胎儿牛血清（FBS），1x青霉素/链霉素在37°C，在20%O₂和5%CO₂中。
2. 种子 5 x 10⁶细胞放入 100 mm 的培养皿中，其 DMEM 为 10 mL，并在 37°C 下孵育过夜。
3. 根据以下方法，用裂化荧光素酶将HBx和DDB1的瞬时转染1μg进入细胞。
   注:质粒DNA转染的量可能取决于所使用的转染。与靶蛋白融合的裂性荧光素酶的最佳位置必须事先确定。在这种情况下，HBx 在 HBx （HBx-LgBit） 的 C 端与 LgBit 融合，DDB1 在 DDB1 的 N 端（SmBit-DDB1）与 SmBit 融合，提供了最佳结果（即最亮的荧光素酶信号）。此过程之前已详细报告⁷。
   1. 在DNA冷凝缓冲液（材料表）中稀释1μg的HBx-LgBit表达DNA质粒和1μgSmBit-DDB1表达DNA质粒（材料表），总体积为300μL。
   2. 加入16μL的增强剂溶液（材料表），通过涡旋混合1s。
   3. 在室温下孵育样品3分钟。
   4. 将60μL转染试剂（材料表）加入样品，通过涡旋混合10s。
   5. 在室温下孵育样品8分钟。
   6. 在孵育期间，从培养基盘中吸出培养基（在步骤1.2中制备），用5 mL的磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞。通过吸入移除 PBS 并添加 7 mL 的 DMEM。
   7. 在含有转染复合物的管中加入3 mL的DMEM。通过移液混合，并将转染复合物添加到10厘米盘中的细胞中。
4. 在5%CO2以下的培养箱中，在37°C下孵育细胞10小时。
5. 根据以下方法，在 5 x 10⁴细胞/孔 50 μL 的介质/孔中，将细胞重新播种到白色 96 孔板中。
   1. 去除废细胞培养基，用5 mL的PBS洗涤细胞。
   2. 通过吸入去除PBS，加入1 mL的0.25%胰蛋白酶-EDTA，并在37°C孵育5分钟以分离细胞。
   3. 加入4 mL的DMEM，通过多次移液在细胞层表面分散介质。将细胞悬浮液转移到管子上。
   4. 在室温下，在500 x g下离心细胞5分钟。
   5. 丢弃上清液，在1mL的PBS中重新悬浮细胞颗粒。
   6. 在室温下将细胞悬浮液在500 x g下离心5分钟，并丢弃上清液。
   7. 用缓冲细胞培养基（材料表）稀释细胞颗粒，辅以10%FBS，种子密度为1.0 x 10⁶细胞/mL。
   8. 将50μL的细胞悬浮液放入96孔板的每个孔中，并将细胞返回到孵化器。
6. 在37°C下孵育细胞，在5%CO₂下孵育10小时。

2. 化合物筛选

1. 在孵育过程中，以13.5倍的浓度稀释筛选化合物（材料表）和溶剂（二甲基磺酸二氧化硫[DMSO]）。例如，如果库存为 10 mM，筛选浓度为 10 μM，则向缓冲细胞培养基的 73.1 μL 中添加 1 μL 的库存溶液。
2. 在每个井中加入12.5 μL的发光基板（材料表），并在室温下孵育5分钟。
   注:作为负控制，板两端的孔（即1和12柱）不应含有发光基板。
3. 使用光度计（材料表）测量基线发光。
4. 在初始测量后，立即添加 5 μL 的化合物，并在步骤 2.1 中控制分量DMSO稀释到每个井中。
   注:最终浓度为10μM。
5. 每 30 分钟测量一次发光值 2 小时。
   注:板应在室温下在黑暗中孵育。
6. 在归一化基线信号后，通过与对照 DMSO 处理进行比较，计算抑制效果。
   注:在重复或三联中筛选每种化合物可以减少变异。

使用该协议后的代表性结果如图2A，B所示。信背景比大于80，Z'因子^9（高通量筛选的黄金标准质量指数）大于0.5，表明该检测系统对于高通量筛选是可以接受的。与对照组（仅限DMSO）相比，阈值设置为>40%抑制，我们确定硝基氧烷为候选药物^7。使用这个系统，通过筛选其他更大的化合物库可以找到更好的候选药物。

图1:HBx-DDB1相互作用的分路素酶分析的原理表示。（A） 使用裂分荧光素酶互补测定系统对HBx-DDB1结合进行基础检测的原理。分离的荧光素酶亚单位LgBit和SmBit分别融合到HBx和DDB1。HBx-DDB1 相互作用使亚单位接近，形成产生发光信号的功能酶。子单元之间的交互是可逆的。（B） 分光荧光素酶测定。在将质粒共同转染后，HBx融合到LgBit，DDB1融合到SmBit，细胞被重新播种到96孔板中。添加发光基板可以测量荧光素酶活性，而无需细胞溶解步骤。加入筛选化合物后可测量路西酶酶活性。请点击此处查看此图的较大版本。

图2:裂性荧光素酶测定的成功结果。（A） 代表基线发光信号来自 96 孔板.路西法酶强度由数字和颜色表示。列 1 和 12 是未添加发光基板的控制。Z' 因子大于 0.5。（B） 在96孔板中加入筛选化合物后，相对荧光素酶活性水平的代表性时间序列结果。x 轴表示标准化到基线荧光素酶活性后与控制 （DMSO） 相比计算的抑制效应。最有效的化合物是硝胺。请点击此处查看此图的较大版本。

我们开发了一种方便的筛选方法，使用裂光酶测定法来发现HBx-DDB1结合抑制剂。相互作用动力学可以在活细胞中实时检测，而无需细胞变热。抑制HBx-DDB1相互作用导致Smc5/6的恢复，导致抑制病毒转录，蛋白质表达和cccDNA生产⁷。这种新的抗病毒作用机制可以克服目前HBV疗法的不足。

虽然有许多方法可用于研究活细胞中的蛋白质-蛋白质相互作用，但检查这些相互作用仍然很困难^。我们的程序很简单，只需要很短的时间来筛选一个96孔板。此外，筛选质量令人满意，Z分高，高通量筛选的黄金标准质量指数^为9。我们的测定可能适用于机器人自动化^11，是药物发现的有效检测。

虽然本文所述的协议使用了HEK293T细胞系，因为它的高转染效率和高增殖能力适合高通量筛选，这种筛选方法可以使用其他细胞系（例如HepG2）进行，无需修改^7。作为筛选化合物的现实策略，HEK293T细胞可用于第一次筛选，随后在第二次验证筛选中使用HepG2细胞。当影响依赖于间接机制时，某些化合物可能不会在不同的细胞系中显示出显著的结果。

由于我们的目的是开发高通量筛选方法，因此有必要进行后续验证研究，以确认已识别的化合物是否作为相互作用抑制剂。此测定中的发光信号水平降低并不总是对应于 HBx-DDB1 相互作用的抑制。细胞毒性试验、共免疫沉淀研究以及进一步的抗HBV实验对于^{确认其效果}具有重要意义。

尽管我们之前通过筛选一个相对较小的化合物库^7，将氮氧化物胺确定为HBx-DDB1相互作用的抑制剂，但可以很容易地进行涉及筛选更大化合物库的进一步研究，以识别能够更有效地抑制蛋白质-蛋白质相互作用的新型化合物。在进行此类进一步筛选时，硝胺可用作检测的阳性对照。此外，此处描述的系统可应用于其他蛋白质-蛋白质相互作用。蛋白质-蛋白质相互作用是药物靶^点12的重要一类。事实上，许多其他病毒与宿主因素相互作用，以复制或表达其致病性^13，14。此处描述的基于裂解的荧光素酶测定，针对病毒蛋白和宿主蛋白之间的相互作用，可能为开发治疗乙肝病毒和其他传染病的新策略提供一种新策略。

作者没有什么可透露的。

这项工作得到了教育部的助学金支持， 文化、体育、科学和技术，日本（#19H03430和#17K09405，#19J11829到K.S.），由创新领域科学研究资助（#18H05024到M.O.），由日本医学研究和发展厅肝炎研究计划，AMED（M.O.，#JP19fk021005），由创新开发和应用新药物乙型肝炎（#JP19fk0310102日本应用酶学基金会和小林癌症研究基金会（M.O.），GSK日本研究赠款2018年（K.S.），以及宫川纪念研究基金会（K.S.）的赠款。