تحديد مثبطات التفاعل HBx-DDB1 باستخدام نظام الفحص التحليلي المنقسم

هنا ، نقدم طريقه لفحص العوامل الفيروسية المضادة للتهاب الكبد B التي تمنع تفاعل HBx-DDB1 باستخدام نظام المقايسة الخاص بالانقسام. هذا النظام يسمح بسهوله الكشف عن تفاعلات البروتين والبروتين وهو مناسب لتحديد مثبطات مثل هذه التفاعلات.

هناك حاجه ماسه للعوامل العلاجية الجديدة للعدوى بفيروس التهاب الكبد B (HBV). علي الرغم من ان النظائر المتوفرة حاليا النيونوس (t) ide تمنع النسخ المتماثل الفيروسية ، فانها ليس لها تاثير مباشر علي التعبير عن البروتينات الفيروسية المنقولة من الحمض النووي الفيروسي الدائري المغلق (cccDNA). كما تحميل مستضد الفيروسية عاليه قد تلعب دورا في هذا السرطان المزمنة وذات الصلة HBV, الهدف من العلاج HBV هو القضاء علي البروتينات الفيروسية. HBV البروتين التنظيمية X (HBx) بربط البروتين الحمض النووي المضيف الضرر الملزمة 1 (DDB1) البروتين لتتحلل الصيانة الهيكلية لكروموسومات 5/6 (Smc5/6) ، مما ادي إلى تفعيل النسخ الفيروسي من cccDNA. هنا ، باستخدام نظام الفحص المتكامل لمسح البيانات ، نقدم نظاما شاملا للفحص المركب للتعرف علي مثبطات تفاعل HBx-DDB1. بروتوكولنا يتيح الكشف السهل لديناميكيات التفاعل في الوقت الحقيقي داخل الخلايا الحية. قد تصبح هذه التقنية فحصا رئيسيا لاكتشاف العوامل العلاجية الجديدة لعلاج عدوي HBV.

فيروس التهاب الكبد B (HBV) العدوى هي مصدر قلق رئيسي في مجال الصحة العامة في جميع انحاء العالم ، مع التقديرات السنوية 240,000,000 الأشخاص المصابين بامراض مزمنة مع HBV و 90,000 الوفاات بسبب مضاعفات العدوى ، بما في ذلك تليف الكبد وسرطان الخلايا الكبدية (اتش سي سي)¹. علي الرغم من ان العوامل العلاجية المضادة لHBV الحالية, النيونوس (ر) نظائرها ide, تمنع بما فيه الكفاية النسخ العكسي الفيروسية, انها نادرا ما تحقيق القضاء علي البروتينات الفيروسية, وهو الهدف السريري علي المدى الطويل. تاثيرها الفقراء علي القضاء علي البروتين الفيروسي ويرجع ذلك إلى عدم وجود تاثير مباشر علي النسخ الفيروسية من الفيروسات الفيروسية بشكل دائري مغلقه الحمض النووي (cccDNA) minichromosomes في نواه الخلايا الكبدية².

يتم تنشيط النسخ HBV من قبل HBV التنظيمية X (HBx) البروتين³. وكشفت الدراسات الحديثة ان hbx يحط من الصيانة الهيكلية لكروموسومات 5/6 (Smc5/6) ، وهو عامل تقييد المضيف الذي يمنع HBV النسخ من cccdna ، عن طريق اختطاف DDB1-CUL4-ROC1 E3 اوبيكويتين يغاز مجمع^4،5،6. ولذلك ، ويعتقد ان خطوه حاسمه في تعزيز النسخ الفيروسي من cccDNA هو التفاعل HBx-DDB1. المركبات القادرة علي تثبيط الربط بين hbx و DDB1 قد منع النسخ الفيروسية ، وفي الواقع تم تحديد نيتازوكسانيد كمثبط للتفاعل hbx-DDB1 عن طريق نظام الفرز المتقدمة في المختبر لدينا⁷.

هنا ، ونحن نقدم نظام الفرز لدينا مريحه تستخدم لتحديد مثبطات التفاعل hbx-DDB1 ، والتي تستخدم المقايسة التكميلية الانقسام لوسيفيراز^7،8. وتنصهر وحدات الوحدات الفرعية لتقسيم لوسيفيراز إلى hbx و DDB1 ، ويجلب تفاعل hbx-DDB1 الوحدات الفرعية إلى القرب القريب لتشكيل انزيم وظيفي يولد اشاره مضيئه ساطعه. وبما ان التفاعل بين الوحدات الفرعية قابل للعكس ، فان هذا النظام يمكنه الكشف بسرعة عن البروتينات DDB1 (الشكل 1). وباستخدام هذا النظام ، يمكن فحص مكتبه مجمعه كبيره بسهوله ، مما قد يؤدي إلى اكتشاف مركبات جديده قادره علي تثبيط تفاعل DDB1 بكفاءة.

ملاحظه: يبين الشكل 1(ا) التمثيل التخطيطي لفحص البيانات التحليلية المجزاه ، وترد عمليه الفحص في الشكل 1باء. ويمكن قياس ديناميات التفاعل في الوقت الحقيقي دون تحلل الخلية.

1. اعداد الخلية

1. الحفاظ علي الخلايا الHEK293Tه المستزرعة في المتوسط النسر دولبيكو المعدلة (DMEM) تستكمل مع 10 ٪ v/v الجنين البقري المصل (سيتم) ، 1x البنسلين/ستربتوميسين في 37 درجه مئوية في 20 ٪ O₂ و 5 ٪ CO₂.
2. بذور 5 × 10⁶ خلايا في صحن 100 ملم مع 10 مل من dmem واحتضان في 37 درجه مئوية بين عشيه وضحيها.
3. Transfect عابره 1 ميكروغرام من HBx و DDB1 مع الluciferases الانقسام في الخلايا وفقا للأسلوب التالي.
   ملاحظه: قد يعتمد مبلغ الحمض النووي البلازميد علي الوصي المستخدم. يجب تحديد الوضع الأمثل لانقسام لوسيفيراز إلى البروتين المستهدف مسبقا. في هذه الحالة, hbx تنصهر إلى lgbit في C-المحطة من hbx (hbx-lgbit) و DDB1 تنصهر إلى smbit في N-تيرمينوس من DDB1 (smbit-DDB1) قدمت أفضل النتائج (اي, ألمع إشارات لوسيفيراز). وقد تم الإبلاغ عن هذه العملية سابقا بالتفصيل⁷.
   1. تمييع 1 ميكروغرام من hbx-lgbit التعبير عن البلازميد الحمض النووي و 1 ميكروغرام من smbit-DDB1 التعبير عن الحمض النووي البلازميد (جدول المواد) في العازلة الحمض النووي التكثيف (جدول المواد) إلى حجم إجمالي 300 μl.
   2. أضافه 16 μL من حل محسن (جدول المواد) ومزيج من vortexing ل 1 s.
   3. احتضان العينة في درجه حرارة الغرفة لمده 3 دقائق.
   4. أضافه 60 μL من الكاشف ترانسفيكشن (جدول المواد) إلى العينة ومزيج من قبل vortexing ل 10 s.
   5. احتضان العينة في درجه حرارة الغرفة لمده 8 دقائق.
   6. اثناء الحضانة ، يستنشق الوسط الثقافي من الطبق (أعدت في الخطوة 1.2) ، ويغسل الخلايا مع 5 مل من الفوسفات-المحلول الملحي المخزنة (تلفزيوني). أزاله تلفزيوني عن طريق الطموح وأضافه 7 مل من DMEM.
   7. أضف 3 مل من DMEM إلى الأنبوب الذي يحتوي علي المجمعات الناقلة. اخلطيها بالأنابيب واضفي المجمعات الناقلة إلى الخلية في طبق 10 سم.
4. احتضان الخلايا في 37 درجه مئوية في حاضنه تحت 5 ٪ CO₂ لمده 10 ساعة.
5. Reseed الخلايا في لوحه بيضاء 96 جيدا في 5 × 10⁴ خلايا/بئر في 50 μl متوسطه/جيدا وفقا للأسلوب التالي.
   1. أزلت ال ينفق خليه ثقافة متوسطه ويغسل خلايا مع 5 [مل] من [ببس].
   2. أزاله تلفزيوني عن طريق الطموح ، أضافه 1 مل من 0.25 ٪ تريبسين-أدتا ، واحتضان في 37 درجه مئوية لمده 5 دقائق لفصل الخلايا.
   3. أضافه 4 مل من DMEM وتفريق المتوسطة عن طريق التنضيد علي سطح طبقه الخلية عده مرات. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب.
   4. خلايا الطرد المركزي في 500 x g لمده 5 دقائق في درجه حرارة الغرفة.
   5. تجاهل ماده طافي وأعاده تعليق بيليه الخلية في 1 مل من تلفزيوني.
   6. الطرد المركزي تعليق الخلية في 500 x g لمده 5 دقائق في درجه حرارة الغرفة وتجاهل supernatant.
   7. تمييع الخلية بيليه مع مخزنه الخلية المتوسطة الثقافة (الجدول من المواد) تستكمل مع 10 ٪ لكثافة البذر من 1.0 x 10⁶ خلايا/مل.
   8. ماصه 50 μL من تعليق الخلية في كل بئر من لوحه جيده 96 وأعاده الخلايا إلى الحاضنة.
6. احتضان الخلايا في 37 درجه مئوية تحت 5 ٪ CO₂ لمده 10 ساعة.

2. الفحص المركب

1. اثناء الحضانة ، تمييع مركبات الفحص (جدول المواد) والمذيبات (ثنائي ميثيل سولفوكسيد [dmso]) في تركيز 13.5 x. علي سبيل المثال ، إذا كان المخزون هو 10 ملم وتركيز الفرز هو 10 μM ، أضافه 1 μL من الحل الأسهم إلى 73.1 μL من المتوسطة الخلية الثقافة.
2. أضافه 12.5 μL من الركيزة الاناره (جدول المواد) إلى كل بئر واحتضان لمده 5 دقائق في درجه حرارة الغرفة.
   ملاحظه: كما الضوابط السلبية ، ينبغي ان الآبار في كلا طرفي لوحه (اي ، الاعمده 1 و 12) لا تحتوي علي الركيزة الاناره.
3. قياس التلالؤ الأساسي باستخدام مقياس الاناره (جدول المواد).
4. مباشره بعد القياس الاولي ، أضافه 5 μL من المركبات والتحكم DMSO المخفف في الخطوة 2.1 إلى كل بئر.
   ملاحظه: سيكون التركيز النهائي 10 μM.
5. قياس قيم التلالؤ كل 30 دقيقه لمده 2 ساعة.
   ملاحظه: يجب احتضان لوحه في الظلام في درجه حرارة الغرفة.
6. حساب الآثار المثبطة بالمقارنة مع السيطرة DMSO العلاج بعد التطبيع إلى إشارات خط الأساس.
   ملاحظه: يمكن ان يؤدي فحص كل مركب في تكرار أو ثلاث نسخ إلى تقليل التباين.

وترد النتائج التمثيلية بعد استخدام هذا البروتوكول في الشكل 2الف وباء. وكانت نسبه الاشاره إلى الخلفية أكبر من 80 وكان عامل Z '⁹ (مؤشر الجودة القياسي الذهبي للفحص العالي الانتاجيه) أكبر من 0.5 ، مما يشير إلى ان نظام الفحص هذا كان مقبولا للفحص العالي الانتاجيه. مع تعيين عتبه > 40 ٪ تثبيط مقارنه مع السيطرة (dmso فقط) ، حددنا نيتازوكسانيد كدواء مرشح⁷. باستخدام هذا النظام ، يمكن العثور علي أفضل الادويه المرشحة عن طريق فحص الأخرى ، ومكتبات مجمع أكبر.

الشكل 1: التمثيل التخطيطي لتحليل البيانات التحليلية المنقسمة لتفاعل HBx-DDB1. (ا) المبدا الذي يقوم عليه الكشف عن الربط DDB1 باستخدام نظام المقايسة التكميلية لتقسيم لوسيفيراز. الوحدات الفرعية لوسيفيراز منفصلة ، lgbit و smbit ، تنصهر إلى hbx و DDB1 ، علي التوالي. التفاعل HBx-DDB1 يجلب الوحدات الفرعية إلى قرب وثيق لتشكيل الانزيم الوظيفي الذي يولد اشاره الاناره. والتفاعل بين الوحدات الفرعية قابل للعكس. (ب) الفحص المجزا للوسيفيراز. بعد دمج البلازميدات للتعبير عن HBx تنصهر إلى LgBit و DDB1 تنصهر إلى SmBit ، تم أعاده البذور الخلايا في لوحه جيدا 96. أضافه الركيزة الاناره تمكن قياس النشاط لوسيفيراز دون خطوه تحلل الخلية. يمكن قياس أنشطه luciferase بعد أضافه مركبات الفحص. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: النتائج الناجحة لعمليه الفحص المجزاه. (ا) إشارات الاناره الاساسيه التمثيلية من صفيحه بئر 96. وتمثل كثافة luciferase بالأرقام وألوان. الاعمده 1 و 12 هي عناصر التحكم التي لم تتم أضافه الركيزة الاناره. وكان عامل Z أكبر من 0.5. (ب) نتيجة السلسلة الزمنيه التمثيلية لمستويات النشاط النسبية للوسيفيراز بعد أضافه مركبات الفحص إلى صفيحه بئر 96. يمثل المحور السيني التاثيرات المثبطة المحسوبة مقارنه بالتحكم (dmso) بعد التوحيد القياسي لنشاط لوسيفيراز الأساسي. وكان المركب الأكثر فعاليه nitazoxanide. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

قمنا بتطوير طريقه فحص مريحه باستخدام اختبار المسح الذي تم تقسيمه للعثور علي مثبطات DDB1 الملزمة من HBx. ويمكن الكشف عن ديناميات التفاعل في الوقت الحقيقي في الخلايا الحية دون الحاجة إلى تحلل الخلية. تثبيط التفاعل HBx-DDB1 يؤدي إلى استعاده Smc5/6 ، مما يؤدي إلى قمع النسخ الفيروسية ، والتعبير عن البروتين ، و cccDNA الإنتاج⁷. هذه اليه الجديدة للعمل المضاد للفيروسات قد تتغلب علي أوجه القصور في علاجات HBV الحالية.

علي الرغم من ان هناك عددا من الطرق المتاحة للتحقيق في تفاعلات البروتين والبروتين في الخلايا الحية ، ودراسة هذه التفاعلات لا تزال صعبه¹⁰. إجراءاتنا بسيطه ويتطلب سوي وقت قصير للشاشة 1 96 لوحه جيدا. وعلاوة علي ذلك ، كانت نوعيه الفحص مرضيه مع ارتفاع درجه Z ' ، ومؤشر الجودة القياسية الذهب للفحص عاليه الانتاجيه⁹. قد يكون لدينا فحص مناسبه لاتمته الروبوتية¹¹ وهو فحص فعال لاكتشاف المخدرات.

وفي حين ان البروتوكول الموصوف هنا يستخدم خط الخلية HEK293T لان فعاليته العالية في النقل وقدرته علي الانتشار العالي مناسبه للفحص العالي الإنتاجي ، يمكن تنفيذ طريقه الفحص هذه باستخدام خطوط خلوية أخرى (علي سبيل المثال ، HepG2) دون تعديلات⁷. كاستراتيجية واقعيه لفحص المركبات ، يمكن استخدام خلايا HEK293T في الفحص الأول تليها خلايا HepG2 في فحص التحقق من صحة الثانية. قد لا تظهر بعض المركبات نتائج هامه في خطوط الخلايا المختلفة عندما تعتمد التاثيرات علي أليات غير المباشرة.

وبما اننا نعتزم تطوير طريقه فرز عاليه الانتاجيه ، فان دراسات المصادقة اللاحقة ضرورية للتاكد مما إذا كانت المركبات المحددة تعمل كمثبطات تفاعل. انخفاض مستويات الإشارات المضيءه في هذا الفحص لا تتوافق دائما مع تثبيط تفاعل HBx-DDB1. اختبارات السمية الخلوية, دراسات ايمونوبريسيبيتيشن, والمزيد من التجارب المضادة لHBV مهمة لتاكيد الآثار⁷.

علي الرغم من اننا حددنا في وقت سابق نيتازوكسانيد كمثبط للتفاعل hbx-DDB1 عن طريق فحص مكتبه مركب صغيره نسبيا⁷، ويمكن اجراء دراسات أخرى تنطوي علي فحص المكتبات مجمع أكبر بكثير من السهل لتحديد المركبات الجديدة التي هي قادره علي تثبيط التفاعلات بروتين البروتين أكثر كفاءه. عند اجراء مثل هذا الفحص الإضافي ، يمكن استخدام نيتازوكسانيد كعنصر تحكم إيجابي لفحص. وعلاوة علي ذلك ، يمكن تطبيق النظام الموصوف هنا علي التفاعلات البروتين البروتين الأخرى. تفاعلات بروتين بروتين هي فئة هامه من أهداف المخدرات¹². في الواقع ، تتفاعل العديد من الفيروسات الأخرى مع العوامل المضيفة للنسخ المتماثل أو التعبير عن الامراضيها^13،14. المقايسة المستندة إلى الانقسام luciferase الموصوفة هنا ، والتي تستهدف التفاعلات بين البروتينات الفيروسية والمضيفة ، قد توفر استراتيجية جديده لتطوير علاجات لHBV والامراض المعدية الأخرى.

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

وقد حظي هذا العمل بدعم من المنح المساعدة المقدمة من وزاره التعليم والثقافة والرياضة والعلوم والتكنولوجيا واليابان (#19H03430 و #17K09405 إلى الأسلوب الذي و#19J11829 إلى K.S.) ، من خلال منحه المعونة للبحوث العلمية في مجالات مبتكره (#18H05024 إلى الأسلوب) ، من قبل برنامج البحوث المتعلقة بالتهاب الكبد من الوكالة اليابانية للبحوث الطبية والتنمية ، AMED (إلى الأسلوب ، #JP19fk021005) ، من خلال برنامج التنمية المبتكرة وتطبيق الادويه الجديدة للتهاب الكبد #JP19fk0310102 المؤسسة اليابانية لانزيمات التطبيقية ومن مؤسسه كوباياشي لأبحاث السرطان (إلى الأسلوب) ، من قبل GSK اليابان منحه البحوث 2018 (إلى K.S.) ، ومنحه من مؤسسه ميياكاوا للبحوث التذكارية (إلى K.S.).