制定唾液抗体多重免疫测定来测量人体暴露于环境中的病原体

In the current climate of scarce resources, new technologies are emerging that allow researchers to conduct studies cheaper, faster and with more precision. Here we describe the development of a bead-based salivary antibody multiplex immunoassay to measure human exposure to multiple environmental pathogens simultaneously.

其病因与人体暴露于环境中的病原体的影响是全球主要的关注，因此，评估接触和感染的使用成本效益，高通量方法的能力是不可缺少的。该原稿描述了能够同时测量抗体在人唾液的存在下，以多种病原体的基于珠子的多重免疫测定的开发和分析。唾液是在本申请中特别有吸引力的，因为它是无创，更便宜和更容易收集比血清。从环境中的病原体的抗原偶联到羧基化微球（珠）和用于测量使用基于珠子的，溶液相测定法在人唾液样品的非常小体积的抗体。珠再加上从空肠弯曲菌，幽门螺旋杆菌，弓形虫，诺如病毒（G I.1和G II.4）抗原，甲型肝炎病毒。以保证抗原充分耦合到珠，耦合用物种特异性的，动物来源的初级捕获抗体证实，随后用生物素化抗物种二次检测抗体和链霉抗R-藻红蛋白记者（SAPE）温育。作为衡量的非特异性结合的对照，一个小珠组被同样处理的其他不同的是它不连接到任何抗原。抗原耦合和控制珠子然后用前瞻性收集的人唾液样品孵育，基于流式细胞术的原理的高通量分析仪测量，和抗体的每个抗原的存在下，在中位数荧光强度单位测定（MFI） 。这个多重免疫测定具有许多优点，包括具有较少样本更多的数据;降低了成本和劳动;并能够自定义检测到许多感兴趣的目标。结果表明，该唾液多重免疫测定可以是能够识别先前接触和感染的，它可以是especiaLLY有用的涉及大型人群监测研究。

腹泻相关的疾病的百分之八十八世界范围内与人体接触到受污染的水，不安全的食品和卫生条件差/卫生有关，造成约1.5万人死亡，其中大多数是儿童^1。这是公共卫生官员和决策者关注的一个重要原因。在努力，调查与水性和其他环境中的病原体相关风险和疾病，我们开发了多重免疫测定来衡量人类样本^2-4的抗体。这种方法可以适用于流行病学研究，以确定人体暴露于这些病原体和更好地确定immunoprevalence和事件感染。

唾液持有相当大的希望作为替代血清人类生物标志物研究。间使用唾液的优点是，非侵入性和易于样品收集，成本低的，并且样品可以容易地从儿童^{5-7 <}收集/ SUP>。血清和唾液样本已经被反对H.抗体广泛的研究幽门螺杆菌 ^2,3,8， 恶性疟原虫 ^9，阿米巴 ^10，隐孢子虫 ^3,11， 肺炎链球菌 ^12，肝炎病毒A和C ^13-14， 诺如病毒 ^{2-4,15，T。}弓形虫 ^2-4，登革热病毒^16，人免疫缺陷病毒^{（HIV）17，}和大肠杆菌 O157:H7 ^18。

一个多重免疫测定允许在单个样本量同时和一个周期或运行中的多个分析物的分析。从C抗原复空肠弯曲菌 ，T。弓形虫，幽门螺旋杆菌，A型肝炎病毒，和两个诺如病毒被用来测量人体唾液的IgG ^2-4和IgA ^3,4-和血浆的IgG ^2,3抗体反应使用这些病原体珠为基础的复用免疫。当在暴露于微生物的水，土壤和食品的流行病学研究结合使用，在此研究中所描述测定的类型可以提供有价值的信息，以提高所造成的环境中的病原体感染的理解。而且，从这些研究获得的唾液抗体的数据可以被用来改善风险评估模型^19-22。

从机构审查委员会获得批准（IRB＃08-1844，北卡罗莱纳州教堂山分校，北卡罗来纳大学，美国），用于刺激沟唾液样本从博克龙海滩，波多黎各，前往沙滩的集合作为美国的一部分环保局（USEPA）国家流行病学和娱乐（NEEAR）水研究²³环境评估，评估中游泳暴露和疾病。研究对象签署知情同意书，并指导对训练的USEPA承包商使用唾液收集装置。唾液样品运送在冰上，在接收，它们被离心，并按照所描述⁴在-80℃下储存。

1.珠激活

1. 通过涡旋和超声处理20秒和存量珠（400微升）到微量离心管转移约5.0×10 ^6个悬浮珠集的股票。
   注:t他珠以12.5×10 ⁶珠/ ml的浓度被提供。
2. 通过以10,000 xg离心离心2分钟沉淀库存珠。
3. 涡旋和超声处理20秒弃上清，100微升重悬珠包衣蒸馏水（DH ₂ O）。重复步骤1.2。
4. 除去上清液并通过涡旋和超声处理20秒重悬洗涤珠在80μl的100mM磷酸二氢钠，pH值6.2的。
5. 在使用前，立即加入200微升的dh ₂ O至10毫克硫代NHS等分使50毫克/毫升N- -hydroxysulfosuccinimide（硫代NHS）的解决方案。涡旋混合。
6. 添加10微升50毫克/毫升硫代NHS的至珠。涡旋混合。
7. 使用前立即，使50毫克/毫升1-乙基- [3-二甲氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐（EDC）溶液中加入200μl的蒸馏水（DH ₂ O），以10毫克EDC等分试样。涡旋混合。
8. 加入10微升50毫克/毫升的EDC溶液到珠子。涡旋混合。孵育小珠在室温下20分钟，在黑暗中，在10分钟的间隔通过涡旋混合。沉淀通过微量离心活化珠以10,000 xg离心2分钟。
9. 除去上清液并通过涡旋和超声处理20秒重悬珠子在250微升50毫2- [N-吗啉代]乙磺酸（MES），pH值5.0。
10. 沉淀通过微量离心活化珠以10,000 xg离心2分钟。
11. 重复步骤1.9和1.10。
    注意:这提供了总共两个洗涤用50mM MES，pH值5.0。
12. 悬浮通过涡旋和超声处理在100μl50mM的MES，pH 5.0的珠为20秒。

2.珠联轴器

1. 耦合抗原使用表1所示的浓度的珠集。
2. 每种抗原添加至活化的珠子和使总体积为500微升的50mM MES，pH值5.0。混合抗原的ð珠涡旋。
3. 孵育2小时的抗原和珠在室温下在黑暗中由旋转（〜15转）混合。沉淀通过微量离心将偶联珠以10,000 xg离心2分钟。
4. 除去上清液，并在500微升磷酸盐缓冲盐水的悬浮珠粒（PBS）中-bovine血清白蛋白（BSA）-polyoxyethylenesorbitan单月桂酸酯（吐温20）钠的叠氮化物（PBS-TBN）通过涡旋和超声处理pH为7.4。沉淀通过微量离心珠以10,000 xg离心2分钟，去除上清。
   注意:叠氮化钠是一种剧毒化学品。吞咽或与皮肤接触得到它是致命的。不要吸入粉尘/烟/气体/烟雾/蒸气或喷雾。穿戴合适的个人防护装备（PPE的）使用时，并按照相应的法律处置。
5. 悬浮通过涡旋和超声处理在1ml的PBS-TBN的珠子，持续20秒。
6. 沉淀通过微量离心珠以10,000 xg离心2分钟。
7. 重复步骤2.5和2.6。
   注:这提供了一个共洗两次用PBS-TBN的。
8. 悬浮耦合和洗涤珠在1ml的PBS，1％BSA，0.05％叠氮化物，pH为7.4。存储偶联珠在黑暗中2-8°C冰箱。

3.珠计数

1. 制备1:10稀释在水中或PBS缓冲液的偶联珠。
2. 负载10微升珠稀释到在样品引入点血球。
3. 计数在4×4角网格之一看到的珠子。计算使用下面的公式偶联珠的总数:计数（4×4栅格的1角）×（1×10 ^4）×（稀释因子）中毫升×悬浮体积。

4.确认抗原耦合

1. 悬浮的通过涡旋和超声处理耦合到感兴趣的抗原，持续20秒珠的库存混合物。
2. 通过稀释偶联珠股最后准备工作珠的混合物100珠/μl的每个唯一珠在PBS-1％BSA的缓冲液（PBS-1％BSA，pH 7.4）中设定的浓度。
3. 准备根据制造商的在用PBS-1％BSA缓冲液96孔圆底板建议至少7两倍抗物种的系列稀释的IgG初级抗体。
4. 预湿的96孔过滤器底部板用100μl洗涤缓冲液的各抗原耦合确认试验的一个独立的8孔柱（8行），并通过真空除去上清液。加入50μl珠混合物（抗原偶联珠）合作，以预湿孔中。
5. 加入50μl抗体稀释到96孔过滤板的各列的行1-7和50微升的PBS-1％BSA缓冲液的排8 代替稀释抗体与作为背景孔。通过上下吹打5次用多通道移液器混合。每抗原偶联珠集执行相同的程序予以确认。
6. 盖，并允许在室温下在黑暗中孵育erature上在500rpm微孔板摇床上1小时。通过真空去除上清液。
7. 用100微升洗涤液洗井和真空上清。重复1X。重悬在50μl的PBS-1％BSA中的珠用多通道移液器。
8. 稀释生物素化抗物种特异性IgG二次检测抗体以在PBS-1％BSA的16微克/毫升。
9. 加入50μl稀释的二级抗体，以每孔移液器上下5次。
10. 覆盖过滤板，并允许在室温下在黑暗中孵育板振荡器上30分钟。通过真空去除上清液。用100微升洗涤液洗井和真空上清。重复洗1X。
11. 重悬在50μl的PBS-1％BSA中的珠用多通道移液器。
12. 稀释链霉亲和R-藻红蛋白记者（SAPE），以在PBS-1％BSA的24​​微克/毫升。
13. 加入50微升记者，每孔和上下吹打5次混匀。
14. C过过滤板，并允许在室温下在黑暗中孵育板振荡器上30分钟。通过真空去除上清液。用100微升洗涤液洗井和真空上清。重复洗1X。
15. 在100μlPBS-1％BSA中的悬浮珠粒和分析使用分析仪²⁹ 50微升。
    注意:基于珠子的多重免疫测定的结果中的中位荧光强度（MFI）进行测定。请务必参阅软件手册的最新版本，如果可避免的错误。

5.唾液多重免疫测定

1. 从-80℃冰箱中取出唾液，并允许在室温下解冻。
2. 悬浮抗原通过涡旋和超声处理20秒偶联珠的股票。
3. 通过稀释偶联珠股100珠/μl的每个唯一珠集的在PBS-1％BSA的缓冲液中的终浓度制备工作珠混合物。
4. 准备1:唾液稀释4W¯¯第i个在96 PBS-1％BSA缓冲好，深孔板。
5. 预湿过滤板用100μl洗涤缓冲液中，用真空除去上清液。
6. 加入50μl工作珠混合物和稀释唾液等体积的95孔中对1的96孔过滤板的:8最终稀释。混合用多通道移液器反应。到了一个控制均匀，加入50微升抗原偶联珠加PBS-1％BSA缓冲液的50微升（如唾液替代）。
7. 盖，并允许在500rpm在室温下在黑暗中孵育1小时对微孔板摇床上。通过真空去除上清液。用100微升洗涤液洗井和真空上清。重复洗1X。
8. 悬浮珠粒于50μl的PBS-1％BSA中的与多通道移液器。
9. 稀释生物素化的山羊抗人IgG第二检测抗体在PBS-1％BSA的16微克/毫升。
10. 加入50μl稀释的第二抗体，每孔内容与混合多通道移液器。
11. 覆盖过滤板，并允许在室温下在黑暗中孵育板振荡器上30分钟。通过真空去除上清液。用100微升洗涤液洗井和真空上清。重复洗1X。
12. 悬浮珠粒于50μl的PBS-1％BSA中的与多通道移液器。
13. 稀释链霉亲和R-藻红蛋白记者（SAPE），以在PBS-1％BSA的24​​微克/毫升。
14. 加入50μl记者到各孔，并用多通道移液器混合。
15. 覆盖过滤板，并允许在室温下在黑暗中孵育板振荡器上30分钟。通过真空去除上清液。用100微升洗涤液洗井和真空上清。重复洗1X。
16. 在100μlPBS-1％BSA中的悬浮珠粒和分析使用分析仪²⁹ 50微升。
    注:多重免疫测定的结果中的中位荧光强度（MFI）为单位进行测量。请务必参阅软件手册的最新版本，如果有的话，以避免错误。

一个唯一的珠集被用来作为测量非特异性结合对照和样品采样变性。这些珠粒相同处理，以与异常的抗原偶联珠，他们不与在偶合步骤中的任何抗原温育。从所有的唾液样本培养控制珠获得MFI值> 500被拆除，由于从进一步分析，从血清中怀疑被污染，其余的答复日志分配。唾液可以与血清污染如果牙龈与附连到收集装置，或者如果在研究参与者都有牙周病海绵擦太剧烈。日志变换MFI数据被用于计算基于所述平均值加上日志的MFI值的3个​​标准偏差505的MFI的免疫阳性的分界点。此外，抗原偶联珠加入到该均在每方式除了稀视为测试井特定井布式唾液用PBS-1％BSA的替换，以评估背景荧光和交叉反应性。在这些背景孔获得的MFI值从每个唾液样品每种抗原偶联珠组的MFI值中减去。

珠偶联使用特异于每种抗原动物来源物种特异性初级检测抗体证实。以保证抗原偶联珠可接近该测定的动态范围的，我们定义适当的连接为MFI≥18,000，剂量响应和初级抗体和<10％的非目标之间交叉反应的观测如上所述² 。代表耦合确认为C.菌和T.在测定抗原的弓形虫示于图1。

根据既定的（505 MFI）的分界点，在immunoprevalence率S为样品（n = 2078）介于约2％（N = 41），用于T.弓形虫到近50％（N = 1009），用于诺罗病毒GI.1（ 图2）。该数据表明，immunoprevalence率最高为诺如病毒随后甲型肝炎病毒和H.幽门螺旋杆菌 。

而样品的32％（N = 672）是免疫阴性的所有的病原体在测定中，68％（N = 1406）为免疫阳性对一种或多种病原体。 图3示出了免疫阳性的击穿的一个或多个的病原体。

图1:耦合分析确认两个在多重免疫测定生物体的所有抗原进行耦合确认和图表为C.。菌和T.弓形虫在该图中repre耦合确认在多重免疫抗原的表性。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2:Immunoprevalence特定病原体 Immunoprevalence特定病原体的多重免疫测定范围为约2％为T.弓形虫近50％为诺如病毒GI.1。对诺如病毒抗原的抗体一般多观察后HAV（甲肝病毒）和H.幽门螺旋杆菌。弓形虫和C.菌抗体的出现频率较低分析唾液样本英寸请点击这里查看次的放大版本是图。

图3:免疫阳性对多种病原体的击穿同时的多重免疫测定允许免疫阳性对多种病原体的50微升样品体积同时分析。几乎检测的唾液样本的三分之一是免疫阴性的对所有在多重抗原抗体。大约样品的31％是免疫阳性一种抗原，而有四分之一是积极的两个抗原。 9.4％是免疫阳性三个抗原。 3％为阳性同时四个或更多的抗原。 请点击此处查看该图的放大版本。

表1:工作珠混合物的多重免疫测定偶联和确认完成后，制备出由每个胎圈组的主混合物，如图所示。主混合物中的分布式在96孔板的孔中的LL。所有孔的与仅含有小珠和PBS-1％BSA缓冲液一个后台控制井的例外唾液中温育。

这些结果表明，在多重免疫测定方法是用于唾液样品是免疫阳性或免疫阴性区分是有用的。为了确定免疫阳性，单个切点通过计算平均值加上的与所有的唾液样品的测试的控制耦合珠粒的日志变换MFI响应的三个标准偏差的发展。截止点，得到以评估曝光和immunoprevalence到单个或多种病原体的能力。这种辨别力可能是调查与接触环境和其他病原体相关的健康风险在人口研究非常有用。

有可以被用于确定取决于小额金融机构的分布，耦合控制和什么问题的研究被设计来回答的截止点其它几种方法。确定临界值的一些例子包括有限混合建模^24-26，平均加3的对照响应的标准偏差，平均加的响应控制2个标准差，以及到对照^27,28响应三次的平均值。对于简单的放映，可以使用较不严格的标准，但对于流行病学研究，可以采用更严格的定义，以减少误报的概率是比较合适的。我们最初的应用是看游泳和非游泳者之间immunoconversion和immunoprevalence。在这项研究中，未偶联的控制微型金融机构没有正态分布并对其结果进行数转换。

优点在执行基于珠子的多重免疫测定包括在时间和劳力，并同时测量多达500的分析物的反应而需要的试剂的最小量的能力的使用非常低的样品体积，减少。相反，评估指示曝光和/或感染的抗体水平的传统方法（ 例如 ，酶联免疫吸附试验）可能需要几个小时才能完成，是劳动密集型的，并且只能用于测量一次一个分析物。这些传统的方法也需要更大的病人/参与者的样本量。例如，大多数的ELISA的要求至少100微升样品的同时多重免疫测定，可能需要50微升或更小。

一个多重免疫测定的限制包括需要严格优化，以确定初级捕获和二次检测抗体，抗原和报告的最佳浓度。交叉反应也是在免疫测定的一个主要问题，因为针对特定抗原的抗体可与来自其它生物体的抗原交叉反应，并由此导致假阳性读数。优化，交叉反应性和非特异性结合先前^2-4解决。任何此类测定法的成功在很大程度上依赖于以获得高度免疫原性抗原的能力以及具体antibo模到这些抗原在珠偶联和偶联确认步骤中使用。另一个限制是特征在于（诊断阳性和阴性）的样品的有限可用性验证实验。

有许多的协议中的关键步骤。这些包括:确保将被耦合到珠不含有外源蛋白，叠氮化物，甘氨酸，三或任何伯胺的抗原。如果任何这些试剂中的抗原制剂存在时，应通过透析或色谱法除去。建议应该用5微克每500万珠抗原的启动和滴定找到最佳的浓度。选择最佳检测抗体浓度给出最佳的灵敏度和动态范围。请记住，信号趋于下降作为抗原检测抗体浓度增加（钩状效应）。例如，如果信号减小作为抗原浓度的增加则检测离子抗体可以进行限制。相反，如果信号减少，因为检测抗体升高记者随后（SAPE）可能会限制。在最佳耦合结合每个蛋白（每个珠子每孔集5000）检查交叉反应的复用。通过与最佳检测抗体结合量的测试多重微珠集。优化记者和由单独测试各抗原使抗原的标准曲线。

排除多重免疫测定，以提高灵敏度，并提高平均荧光信号是非常重要的。为了提高灵敏度，降低或联接到珠或检测抗体浓度的抗原的量。用于捕获和/或检测使用较高亲和力的抗体也可提高灵敏度。增加耦接至小珠的抗原的量可以增加平均荧光信号。一项研究表明，预温育polyvinylal血清样品cohol加聚乙烯吡咯烷酮（PVX）缓冲液，能够抑制非特异性在使用基于珠子的多重测定³⁰血清学检测结合如我们所描述这里所述一个。然而，另一项研究由我们的合作者发现PBS-BSA和PVX缓冲区之间没有显著影响。他们进一步，由于PVX缓冲器的较高粘度的，它创建了在分析仪珠采集和形成泡沫在微孔板孔³的问题的结论。

总之，我们已经提出了能够测量在非常小的样品体积同时人类唾液IgG抗体多种病原体的存在的方法。在未来，该测定将用于检测与游泳相关暴露或感染相关的唾液的抗体的存在，并帮助告知风险评估模型。另外，该测定可用于测量与空中和食源性exposur相关抗体ES，确定事件发生感染或immunoconversions，并提供关键的免疫信息进行流行病学问卷式人口研究。

美国环境保护署通过其研究和发展办公室资助和管理这里所描述的研究。它一直受到机构的行政审查和批准发布。商品名称或商品的提及，并不构成认可或推荐使用。

Clarissa Curioso was supported through an appointment to the Research Participation Program at the U.S. Environmental Protection Agency administered by the Oak Ridge Institute for Science and Education through an interagency agreement between the U.S. Department of Energy and U.S. EPA.