生物医学植入物的石墨涂料

石墨烯具有潜在的生物医学植入物的涂层材料。在这项研究中，我们展示了一个涂层镍钛记忆合金合金纳米厚的石墨层的方法，并确定如何石墨烯可能会影响植入物的反应。

作为表面涂层​​具有原子级平滑的石墨烯的潜力，以改善植入物的性质。这表明涂层镍钛记忆合金合金作为支架材料的应用与纳米厚的石墨层的方法。石墨烯是通过化学气相沉积铜基板上生长，然后转印到镍钛合金基板。为了了解石墨烯涂层可以改变生物反应的大鼠主动脉内皮细胞和大鼠主动脉平滑肌细胞，细胞存活率的影响。此外，用荧光共焦显微镜检查细胞粘附和形态上的石墨烯涂层的效果。细胞进行染色，肌动蛋白和核，和原始的镍钛合金样品之间有明显的差异相比，石墨烯涂覆的样品。总大鼠主动脉平滑肌细胞的肌动蛋白表达被发现使用免疫印迹。蛋白质吸附特性，潜在的血栓形成的指标，WERE琼脂糖凝胶电泳血清白蛋白和纤维蛋白原。此外，纤维蛋白原的电荷转移到基板推导出了利用拉曼光谱。有人发现，石墨烯涂层的镍钛合金基板满足的支架材料的功能要求和改善的生物反应相比，未涂覆的镍钛合金。因此，石墨涂层镍钛记忆合金的支架材料是一个可行的候选人。

过去三十年目睹发现的新型材料为基础的治疗和疾病的治疗和诊断设备。新型合金材料，例如镍钛合金（NiTi合金）和不锈钢通常用在生物医学植入物的制造，由于其优异的机械特性^。1-3，但众多的挑战仍然由于外源性材料的细胞毒性，生物和血液相容性。的金属的性质，这些合金的结果较差的生物和血液相容性由于金属浸出，缺乏的细胞粘附，增殖，血栓形成，当涉及在流动的血液接触（如导管，血管移植物，血管支架，人工心脏瓣膜与植入物表面的蛋白质或活细胞等 ^{）。1，4，5}的相互作用可导致强烈的生化反应的免疫学反应和随后的级联可能产生不利影响的移动设备的功能。因此，它被pertin耳鼻喉科在生物医学植入物和其周围的生物环境之间的相互作用来实现控制。通常采用的表面改性，以减少或防止不利的生理响应，源自植入材料。一个理想的表面涂层，预计有高的粘合强度，化学惰性，高平滑性，和良好的血液和生物相容性。在此之前，许多材料包括类金刚石碳（DLC），碳化硅，氮化钛，TiO ₂和许多聚合物材料已被测试的生物相容的植入物表面涂层^1，6-23然而，这些材料仍然无法满足所有一个合适的植入物表面涂层的功能标准。

发现SP ^2，被称为石墨烯，碳原子厚的一层敞开了大门，为发展新型多功能材料。石墨烯是种植体表面涂层的，因为它是一个理想的候选人是化学惰性的，原子级平滑和高度耐用的。在这封信中，我们研究了石墨烯的可行性，为生物医学植入物的表面涂层。我们的研究表明，石墨涂层镍钛记忆合金（GR-镍）满足所有的功能标准，同时还支持优秀的平滑肌和内皮细胞的生长，导致细胞增殖，以更好地。我们还发现，血清白蛋白吸附在镍GR-高于纤维蛋白原。更重要的是，（i）本详细的光谱测量证实了缺乏表明，石墨涂层石墨，纤维蛋白原之间的电荷转移抑制血小板活化植入物，（ii）石墨烯的涂料不表现出任何重大的体外毒性内皮细胞和平滑肌细胞系的确认其生物相容性，及（iii）的石墨烯涂层是化学惰性的，耐用的和不可渗透的，在流动的血液环境。这些血液和生物相容性，随着高STrength，化学惰性和耐用性，使石墨烯作为一个理想的表面涂层涂料。

1。石墨涂层的镍

1. 铜（Cu）的基板使用的化学气相沉积技术，在本研究中所用的石墨烯样品上生长，并随后将其转移至4.5毫米² NiTi合金基板。
2. 铜箔（1厘米×1厘米）被放置在一个1英寸的石英管式炉，和50sccm的H _2，450sccm的Ar的存在下，在加热到1000℃。
3. 往下，甲烷（1和4 sccm的）引入炉中20-30分钟，在不同的流率。对样品进行了最终冷却至室温，在流动下的Ar和H _{2，CH 4。}
4. 接着，旋涂的Cu箔与PMMA（用4％苯甲醚）稀释，在4,000 rpm下，随后在150℃下5分钟的热处理得到石墨烯PMMA层上，通过蚀刻的Cu箔使用Transene公司公司，CE-100腐蚀剂，并随后在10％HCl和去离子水冲洗10分钟。
5. 的samples被转移到：NiTi合金基板（4.5毫米^2），退火温度在450℃下，在Ar（300 sccm的）和H _2（700 sccm）的2小时以除去的PMMA。最后，底物用丙酮洗涤，溶解残留的聚甲基丙烯酸甲酯，得到的Gr-NiTi合金样品。一个Dilor XY三联光栅单色仪被用于微的拉曼表征（使用100X客观）的所有GR-NiTisamples 514.5nm的^氩离子激光激发。

2。 体外毒性的GR-镍

培养大鼠主动脉内皮细胞（细胞应用公司），明胶涂层8室幻灯片。为了测试细胞的生长，质朴的和GR-NiTisubstrates的被安置在井没有任何明胶涂层。用Hitachi S-4800扫描电镜扫描电子显微镜图像。此外，大鼠主动脉平滑肌细胞生长在CellBind 96孔板中都作为对照组（康宁）lbecco的改良的Eagle培养基（ATCC）。

1. 为了测试细胞活力，细胞（内皮细胞和平滑肌细胞）接种在10 ^5个细胞/孔在井含有原始的NiTi合金，1 sccm的或4 sccm的的Gr-NiTi合金基板，其中所述sccm的对应中所用的甲烷流的石墨烯CVD增长。细胞生长所需的时间段的培养箱中在37℃和5％CO _2，交换介质隔日。
2. 在结束时间点，除去培养基，含0.5毫克/毫升噻唑基溴化四氮唑蓝（或MTT得自Sigma）的新鲜培养基加入到各孔。额外的3小时，然后将细胞孵育。对于MTS测定，媒体除去在最后的时间点，用120μl的MTS工作液（细胞层96水溶液，Promega）中，温育3小时代替。
3. 接着，媒体轻轻地除去和100毫升二甲亚砜（Sigma公司）加入到各孔。移植后翼10分钟溶解的MTT晶体，将该溶液转移到另一个孔板。对于MTS测定，没有二甲基亚砜加入到孔中。好内容被转移到一个新的平板。
4. 吸光度在490nm处读出，并通过正火纯净的NiTi合金样品的平均吸光度，吸光度测定的百分存活率。至少有五个重复进行对每个样品类型。

3。共聚焦显微镜细胞形态研究

1. 共聚焦成像的大鼠主动脉平滑肌细胞，基板放置在8室幻灯片（Thermo Scientific的）。在接种细胞以25,000细胞/腔室中，在37℃和5％CO _2下培养3天。
2. 细胞被固定在基板上，用4％甲醛的磷酸盐缓冲盐水中20分钟。
3. 透性为0.1％的Triton-X 1分钟。
4. 肌动蛋白染色用Alexa Fluor 488鬼笔环肽（LIFË技术）。在甲醇中的200单位/ ml加入100μl的488 alexafluor，鬼笔环肽在溶液中加入1.9毫升磷酸盐缓冲盐水。细胞进行染色，用250微升488 alexafluor鬼笔环肽45分钟，然后用磷酸盐缓冲盐水洗涤两次。
5. 核安装VectaShield荧光安装介质含DAPI（向量实验室）的。共聚焦图像采集使用的是尼康共聚焦TI。甲腔室接种没有任何基板与细胞中被用作对照。

4。蛋白质吸附的研究

1. 基板尺寸蛋白质吸附实验开始前用卡尺测量。采取三个测量值的大致正方形的样品的每一侧和平均得到的长度和宽度。
2. 每个样品，原始的NiTi合金，1sccm和4sccm的Gr-NiTiwere孵育用1毫克/毫升白蛋白的磷酸盐缓冲盐水（PBS）或1毫克/毫升纤维蛋白原在PBS中在室温吨emperature为3小时。
3. 相同方式样本合并还原样品缓冲液中的200μl的微量离心管中，并煮沸5分钟。
4. 然后将样品稀释的Tris /甘氨酸/ SDS缓冲液（Bio-Rad公司），并运行通过4-15％Tris聚丙烯酰胺电泳凝胶（Bio-Rad公司），在100分钟的90 V。
5. 凝胶染色与SYPRO红。稀释：SYPRO红（Life Technologies公司）的股票在7.5％（V / V）醋酸溶液，1:5000。染色凝胶60分钟。
6. 影像的凝胶使用Flourchem SP（阿尔法INNOTECH公司）。荧光强度定量使用ImageJ的软件。从每个样品的荧光强度进行归一由基板的总面积和纤维蛋白原吸附相比，白蛋白吸附。

5。 Western印迹蛋白表达

1. Western blot检测进行分析总肌动蛋白的大鼠主动脉平滑肌细胞。细胞接种在10,000个细胞/底物，在96瓦特埃尔板。
2. 3天前取出介质细胞生长。用RIPA缓冲液，和一个标准的BCA测定（LAMDA）进行量化总蛋白提取细胞总蛋白。
3. 将样品稀释到相同浓度在RIPA，然后煮沸5分钟，在还原性样品缓冲液。
4. 由4-15％Tris聚丙烯酰胺凝胶通过电泳分离蛋白质，在90 V为100分钟。一个万花筒蛋白标准（BIO-RAD）是用来评估蛋白质分子量。
5. 蛋白质转移到PVDF膜上，并用1％无脂干牛奶（Bio-Rad公司）溶液中断。
6. 总肌动蛋白标记的兔抗鼠的肌动蛋白抗体（Sigma）。甲BM化学发光试剂盒（Roche），用于检测第一抗体。膜使用FlourChem SP成像设备和使用ImageJ软件测量荧光强度成像。荧光强度比较归一化的初级斯坦NiTisample。

图1。）CVD法生长的多晶石墨在Cu箔模仿金属晶粒（比例尺：10微米）。 B）1的SCCM（4 SCCM）石墨烯的拉曼光谱显示了强烈的（相对较弱）G'带指示单层（数层）所制备的石墨烯的性质。三）转印到NiTi合金的石墨烯的AFM图像显示为〜5 nm的粗糙度。比例尺= 500纳米。

图2 a）控制玻璃载片上生长的平滑肌细胞的共焦光学显微镜图像， 二）原始的NiTi合金， 三）的Gr 1 sccm的NiTi合金和d）的Gr 4 sccm的NiTi合金基板（比例尺：50微米）。

图3。）MTT法表明的Gr-NiTi合金基板（1和​​4 sccm的）不表现出相对于原始的NiTi合金SMC细胞存活率的显着差异。 二）MTS实验表明，在3天的细胞的生存能力RAECs不显着比对照组有所不同。

扫描电子显微镜图像如图4所示。RAECs长大了）纯镍，B）1 SCCM GR-镍和c）4 SCCM GR-镍基板显示，石墨涂层导致更好的球形细胞形态RAECs。比例尺为10μm。

图5A）纤维蛋白原/白蛋白比率为原始GR-镍（镍，1和4 sccm的样品）。 二）纤维蛋白原和电子态密度的石墨烯的平衡费米能级的能级图。从被占领的GR-镍在相同的能量水平成空电子态的纤维蛋白原分子电子态的电子从纤维蛋白原转移到GR-镍是唯一可能的。无论是单数层石墨烯的半金属在室温下具有密度低，在EF导致一个弱（相对于裸露的镍钛记忆合金纤维蛋白原）电荷转移到石墨烯。

图6。石墨烯不表现出任何变化，G-带的线型或频率指示的情况下从血浆蛋白的任何电荷转移。的解卷积泰德峰曲线拟合显示为黑色。

图7。）石墨烯涂覆的部分暴露的Cu便士至5％H _{2 O 2}保持不变而揭露的部分变色。b）否在我们的观察，在G-带的频率的变化的Gr 原位拉曼研究镍HNO ₃浸泡在70％，确认石墨涂层的耐用性。 三）的CE 100溶剂中的铜蚀刻时间增加一倍，当铜涂有石墨烯（GR-镍）表示石墨烯膜的抗渗性。

生物相容性和细胞毒性：化学气相沉积（CVD）方法，得到多晶石墨烯样品，模仿铜的晶粒，如在图1a中所示。我们采用拉曼光谱，以确认存在的数层（单层）石墨烯1 SCCM（4 SCCM）样品（ 见图1b）。很显然，1 sccm的（4 sccm）的样品表现出强烈的（相对较弱）G'带表示单层的（少数层）石墨烯。 图1c示出了在NiTi基板少数层石墨烯的原子力显微镜（AFM）图像。我们的详细的测量产生的表面粗糙度的值_R Q = 5 nm的转移的石墨烯层（的Gr-NiTi合金）。这是众所周知的，在纳米结构的表面形貌强烈影响细胞的形状和在血管内皮细胞和平滑肌细胞的细胞骨架组装。这些细胞系反应的机械应力，通过改变它们的脂质双层流动性，这可能会产生不利影响蛋白易位和活化剂，如钙离子进入细胞的条目。更重要的是，在细胞膜上的应力梯度增加可以改变细胞表面受体的构象和密度。为了测试石墨烯涂层的细胞上的应力梯度的影响，我们研究了平滑肌和内皮细胞的形态使用显微技术。

正如图2中所示，平滑肌细胞（SMC）在纯净的NiTi合金形态的非球面。另外，细胞稀疏分散表明纯净的NiTi合金的平滑肌细胞粘附力较弱。与此相反，平滑肌细胞致密，球形的Gr-NiTi合金表面（1和4 sccm）的类似的控制。石墨烯涂层减少应力梯度的细胞中，通过提供更光滑的表面（显而易见的，从图1c中所示的低 R _q值），因此，结果在一个更好的细胞形态。为了测定细胞生存力和增殖，我们进行MTT法测定平滑肌细胞生长在纯净的和Gr-NiTisubstrates的的在第3和7天的时间点上。在这个测定法，MTT染料（黄色）被还原成甲臜染料（紫色）由有源还原酶的酶，并因此，健康和增殖的细胞（或材料的细胞毒性），可以通过进行比色测量量化。 如图3a所示，我们并没有观察到任何毒性显着的变化GR-镍基板后3天和7天。这些结果证实，石墨烯涂层不纯净的NiTi合金基板本身相比诱导过量毒性。

再次确认石墨烯涂层的效果，我们进行了详细的电子显微镜成像实验大鼠的主动脉内皮细胞（参见图4）上。原始的镍基体上的细胞稀疏，细长的，而他们是椭圆形和d恩瑟GR-镍基板。这种改进的细胞形态和密度被认为是类似于确认所提供的石墨烯涂层的应力梯度降低平滑肌细胞。此外，我们测量石墨烯涂层的细胞毒性RAEC使用MTS 3 - （4,5 - 二甲基吡啶-2 - 基）-5 - （3 - 羧基甲氧基苯基）-2 - （4 - 磺基苯基）-2H-四唑测定。使用MTS测定（而不是MTT）的基本原理在于更好的兼容性的的RAEC生长介质和条件。如在图3b中所示，我们的血管内皮细胞上的MTS实验表现出非常良好的细胞生存力和增殖，确认从石墨烯涂层，即使对于RAEC没有多余的毒性。更重要的是，1和4 sccm的GR-镍石墨层的数量没有表现出显着的变化，在细胞增殖时提示不依赖细胞的形态。

蛋白质吸附和血液相容性：血液凝固在植入材料公顷附近已经在植入技术的主要障碍之一，自2003年以来。正如前面提到的，所述植入物材料触发凝血级联反应，当它进入与血液接触。之间的相互作用的生物医学植入物和血液开始与吸附的血浆蛋白（血清白蛋白，纤维蛋白原等 ），在其表面上。最初，非常丰富的蛋白质，如血清白蛋白，flbrinogen，和flbronectin的吸附，但后来换成第十二因素和高分子量激肽原。在测定血液相容性生物材料吸附flbrinogen和白蛋白的比例是至关重要的。在此之前，低比例的一种生物医学植入物表面上吸附的纤维蛋白原/白蛋白已与低血小板粘附和血栓形成¹如在图5a所示的Gr-NiTi合金具有低纤维蛋白原/白蛋白相对到原始的NiTi合金暗示更好的血液相容性所产生的比石墨烯。 FIB / ALB慧慧o是显着降低为1和4 sccm的GR-镍的血液相容性的石墨烯层是独立的。

它是已知的，从纤维蛋白原分子中的电子传递到植入物是负责作为第一步，形成纤维蛋白血栓增长。正如在图5b中所示，纤维蛋白原具有半导体类似的电子态密度或DOS（ 由p（E）表示）的能隙为1.8eV。费米能级（EF）的纤维蛋白原和Gr-镍在它们的界面平衡。纤维蛋白原每一个电子的电荷转移所需的纤维蛋白形成的原始镍，纤维蛋白原分子的电子转移到GR-镍是唯一可能的从被占领的纤维蛋白原分子的电子态成空电子态的GR-镍在相同的能量水平。无论是单数层石墨烯的半金属在室温下的低P（E） 24>在_E F附近。因此，从纤维蛋白原石墨的电荷交换电流是微不足道的（如相比，裸镍钛合金）由于低的 p值（E）。这种内在属性的石墨烯涂层是至关重要的任何电荷转移抑制纤维蛋白原（和随后的血液凝固）。

我们采用显微拉曼光谱，，确认纤维蛋白原和Gr-镍之间的电荷转移动力学的确是微不足道的。石墨烯的拉曼光谱呈现出几个尖锐特征，由于共振效应。值得注意的是，从平面状的碳原子的振动产生的切向的带（G带 ），曾发现是高度敏感的，电荷转移^，25 G-带的频率是已知的换高速档（降档）时，任何接受体（供体）的物种交互与石墨通孔（电子）转移。更重要的是，G-带 dev的的线形从对称洛伦兹的iates不对称的Breit-维格纳-法诺（BWF）线形电荷转移^。25正如预期的那样，我们并没有观察到在G-波段频率的石墨烯转移后，吸附的纤维蛋白原确认的情况下电荷转移GR-镍和纤维蛋白原（ 图6）。这种电荷转移和低FIB / ALB比的抑制，表明石墨涂层良好的血液相容性。

石墨烯涂层的化学惰性：石墨烯是已知的作为一个保护层，由于其独特的物理化学性质。其SP ²蜂窝状晶格提供了一个天然的扩散阻挡层，从而防止金属离子的淋失的植入材料。最近，石墨烯已被用作一个微观气密球囊²⁶和保护涂层的沉积Cu / Ni ²⁷虽然稳定性和抗渗性的石墨烯以及记录在升ATURE，我们提出了相关的数据蚀刻的铜硬币，在图7中重申植体涂料的实用性和可行性的石墨烯。如在图7a中示出，石墨烯涂覆的硬币（〜95％Cu）的保持部时，从氧化保护暴露于H ₂ O _2，而裸露的区域接触时的硬币成为此变色，用5％H _{2 O 2（}见放大的光学显微镜图像在图7a）。

要测试的石墨烯涂层的耐久性，我们暴露的Gr-NiTi合金基板到70％的硝酸，直到的NiTi部分被​​蚀刻掉。我们在沉浸在HNO ₃ GR-镍的原位拉曼光谱没有发生变化，在D-和G-带的石墨烯暗示，石墨涂层是非常耐用（ 图7b）。此外，我们发现，石墨烯中的Gr-NiTi合金涂层降低底层COPPE的刻蚀速率r作为如图7c所示。

总之，我们的详细的光谱测量证实了石墨，纤维蛋白原，石墨涂层抑制血小板活化的植入缺乏之间的电荷转移。此外，石墨烯涂料不表现出任何重大的体外毒性内皮细胞和平滑肌细胞株，确认其生物相容性。此外，石墨烯涂层被发现是化学惰性的，耐用的和不可渗透的，在流动的血液环境。石墨涂层沿着它的化学惰性的生物和血液相容性，耐用性和抗渗性，使石墨烯独特的涂层材料，生物医学植入物。最后，我们注意到，我们成功地转移到单个镍纤维的石墨薄片，用可制造石墨涂层的网状。我们还开发了化学剥离的石墨薄片，可以直接旋涂ONTØ网格状的支架。此外，我们的初步实验表明，它确实有可能直接生长石墨烯镍合金。

没有利益冲突的声明。