Method Article
我们描述的隔离乳鼠心肌细胞,并准备在组织工程中的纤维蛋白凝胶结构的封装的细胞。我们描述了分析后,电刺激和细胞活力,免疫组织化学染色后产生的积极力量的文化时期,包括组织工程化心肌的方法。
培养细胞在一个三维凝胶环境是一个重要的技术发展为组织工程的结构,以及研究各种体外培养条件下细胞的反应。三维环境更紧密地模仿什么细胞在体内观察到的,由于机械和化学刺激的应用在所有尺寸1。三维水凝胶可以从合成的聚合物,如PEG - DA 2 和 PLGA 3或自然产生的蛋白质, 如胶原蛋白4,透明质酸或纤维蛋白6,7。从一种自然产生的凝血蛋白,纤维蛋白,创建的水凝胶,可以聚合,形成一个网格,是身体的自然伤口愈合过程8的一部分。纤维蛋白是细胞降解和潜在的自体9,使其成为一个理想的临时支架用于组织工程。
在这里,我们详细描述了隔离乳鼠心肌细胞进行为期3天的幼鼠和准备在组织工程中的纤维蛋白凝胶结构的封装的细胞。新生儿心肌细胞在心肌组织的形成和工程4体外研究使用一个共同的细胞来源。纤维蛋白胶混合纤维蛋白原酶凝血酶。凝血酶裂解纤维蛋白原fibrinopeptides FPA和FPB,揭示了相互作用的结合位点, 与其他10个单体。这些相互作用导致单体的自组装,形成了水凝胶网状的成纤维。由于这种酶反应的时间可通过改变比例的纤维蛋白原,凝血酶或钙的比例凝血酶的调整,可以注塑模具11,12不同的几何形状结构。此外,我们可以生成所产生的组织保持一致,我们如何限制在13文化凝胶。
心肌细胞培养工程静态条件下两个星期的心肌组织结构后,已经开始改造构造,可以产生 6电起搏条件下的收缩力。作为本协议的一部分,我们还描述分析改造后的文化时期,包括心肌所产生的主动力的功能分析后确定最终的细胞活力电刺激的方法,以及构造(现场死亡的心肌组织的方法法)和免疫组织化学染色检查的收缩(肌球蛋白重链或MHC)和心肌细胞之间的耦合(连接蛋白43或Cx43的)重要的典型蛋白的表达和形态。
1。新生儿心肌隔离- 准备(前一天)
在本节中创建的解决方案:PBS -葡萄糖溶液,停止媒体。
2。新生儿心肌隔离- 准备(丰收的一天)
请务必保持无菌
本节中使用的解决方案:PBS -葡萄糖溶液,优碘
3。新生儿心肌隔离- 心脏夹层
本节中使用的解决方案:优碘,PBS -葡萄糖溶液
4。新生儿心肌隔离- 心肌细胞隔离
在本节中创建/使用的解决方案:PBS -葡萄糖溶液,胶原酶的解决方案,一站式解决方案
5。铸造纤维蛋白凝胶结构- 准备创建纤维蛋白胶(提前完成)
解决方案创造了本节中的纤维蛋白原原液,凝血酶原液,Pluronics的解决方案,心肌构建媒体。
6。铸造纤维蛋白凝胶结构- 纤维蛋白胶的制备(前纤维蛋白凝胶结构 )
本节中使用的解决方案:Pluronics解决方案
7。铸造纤维蛋白胶的结构通过注塑
解决方案在本节创建:F解决方案,T解决方案,电池解决方案 。
8。分析技术(文化2周后) - 收缩力测试
本节中使用的解决方案:DMEM,心肌构建媒体 。
9。分析技术(文化2周后) - 活死含量可行性(Invitrogen公司现场/死含量)14:
本节中使用的解决方案:EthD - 1原液,钙黄绿素AM原液 PBS
10。分析技术(文化2周后) - 重要的心肌细胞蛋白的免疫组化 :
本节中使用的解决方案:PBS中,4%paraformadehyde PBS中,5%驴血清的PBS,PBS,0.1毫微克/毫升的PBS Hoechst 33258荧光抗体 。
11。代表性的成果/成果:
心肌纤维蛋白构造初步覆盖整个模具的宽度(图2B)。无气泡,应该存在于构造,它看起来应该在整个长度的统一。经过两个星期的培养,约1 / 4的初始宽度(图2C)的建造合同。
当构造的电气节奏,在我们自定义的收缩力装置(图3A),抽搐力数据可以生成,如图3b所示。波形可以在MATLAB(MathWorks公司)分别进行分析,确定力,收缩率和松弛率。抽搐部队约1.3分钟,预计6。
细胞构造的可行性是依赖于构造的深入,由于进入兴建中的氧气扩散的限制。在表面的构造图4A,观察细胞存活率高。共聚焦显微镜,图4B,对齐的构造结构是由于肌球蛋白重链,MHC的观察,收缩,显示为红色的重要。连接蛋白43,以绿色显示,心肌细胞之间的耦合是必要的。
图1:封装过程概述
图2:一)单独和联合纤维蛋白胶的模具零件。 FRO米左到右:两个聚四氟乙烯垫圈,两个硅胶O型圈,聚四氟乙烯棒,聚四氟乙烯管,完成芯棒,芯棒的外壳,柱塞)。 b)建造在模具上后,立即从外壳(0天)弹射。三)夯实构建模具(红色箭头),13天的文化。
图3:一)自定义的收缩力记录抽搐力测量系统。一个后力传感器措施的收缩力和结果输出到计算机。洗澡含有两个碳电极用导线连接到电刺激的步伐构造。两个职位举行的地方兴建。 b)样品抽搐力波形数据在0.5赫兹的电刺激产生的。
图4:a)活/死构造,第13天(比例尺= 400微米)的检测。绿色代表了活细胞和红色代表的死细胞。 B)共聚焦显微镜图像的肌球蛋白重链(红色),连接蛋白43(绿色)和赫司特核染色(蓝色)(比例尺= 10微米)。
F解决方案 | T解决方案 | Cell解决方案 | |||
纤维蛋白原 | 112μL | 凝血酶 | 17μL | 细胞的DMEM | 170μL |
HEPES | 558μl | 钙离子 | 1.3μL | ||
DMEM培养液 | 152μL | ||||
共有 | 670μL | 共有 | 170μL | 共有 | 170μL |
表1纤维蛋白凝胶的解决方案,数量为1毫升的凝胶。
注:纤维蛋白原= 33 mg / ml的20毫米的HEPES纤维蛋白原缓冲液
HEPES = 20 mM的HEPES缓冲液
在0.81%NaCl溶液中的凝血酶= 25 U / mL的溶液
钙+ + = 2 N的氯化钙溶液
乳鼠心肌细胞在纤维蛋白凝胶结果在体外培养的心肌系统模型在一个一致的和可行的的三维封装。纤维蛋白是生物材料的首选,因为当细胞包埋,他们是代谢活跃,并能够压缩,重塑和再造细胞外基质,是符合本机的心脏组织 12 。因为我们允许心肌细胞排列在这种环境下,其功能是心脏肌肉造成较大的收缩力相比,6各向同性组织特征。对于潜在的治疗应用,这是必要的封装内的材料,促进活力和功能的细胞。这里介绍的协议示范创建纤维蛋白网络控制在一个三维微环境的心肌细胞的行为有效率及准确的手段。
一些潜在的问题可能出现在这些结构的建立和文化。一个潜在的问题是维持细胞活力封装之前,这将显著影响构造的功能。应作出努力,通过减少之间的隔离和纤维蛋白凝胶内的细胞封装时间隔离限制细胞死亡。构造应提供媒体隔日一个严格的时间表。此外,重要的是要确保在所有的解决方案,用于同质化。如果纤维蛋白原,凝血酶和细胞的混合物产生异构环境中,细胞的能力,改造的ECM,机械夫妇和合同是潜在的阻碍。同样重要的是为了防止干扰,在工程组织的连续性,以防止注入的构造过程中形成的气泡。缓解这一问题的方法之一是吸引更多的凝胶,比需要构造,使之成为注射器慢慢注入。最后,一旦纤维蛋白基质已成立,并在培养液中24小时,这是必须脱离环模双方的构造,以促进纤维蛋白凝胶细胞为基础的压实。保持在中间的模具构造,有利于气体和营养交换。坚持环模双方还可能破坏所需的细胞对齐。
重要的是要注意在这个协议的euthanization方法,这是一个可以接受的方法,由国家卫生部和美国兽医协会研究院的指引下,自觉斩首。然而,一些机构建议新生大鼠断头的麻醉剂使用。我们选择了有意识的断头,因为它保证最短的时间内切除的心脏组织/细胞缺氧条件下。相对少量的缺氧可导致心肌缺血和潜在的心肌细胞死亡,这可能显著影响本协议的成果。
没有利益冲突的声明。
这项工作是支持的国立卫生研究院 - 国家心脏,肺和血液研究所(奖#R00HL093358以六味地黄丸)。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
试剂名称 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
---|---|---|---|
氯化钠 | 西格玛 | S7653 | PBS |
氯化钾 | 西格玛 | P9333 | PBS |
磷酸氢二钠钠 | 西格玛 | S7907 | PBS |
磷酸二氢钾 | 西格玛 | P5655 | PBS |
血糖 | 西格玛 | G5400 | 隔离 |
止血 | 精细科学的工具 | 91308-12 | 隔离 |
精细镊子 | 精细科学的工具 | 11251-20 | 隔离 |
大剪刀 | 精细科学的工具 | 91401-14 | 隔离 |
微型剪刀 | 精细科学的工具 | 91501-09 | 隔离 |
手术刀处理 | 精细科学的工具 | 10008-13 | 隔离 |
手术刀刀片 | Fisher Scientific则 | 08 - 918 - 5A | 隔离 |
吸水板凳underpad | VWR | 56617-014 | 隔离 |
无菌悬垂 | Fisher Scientific则 | GM42526 | 隔离 |
高压灭菌袋 | 费舍尔 | 01-812-54 | 隔离 |
纱布 | Fisher Scientific则 | 13-761-52 | 隔离 |
优碘 | 普渡产品 | 67618-150-01 | 隔离 |
无菌手套 | Fisher Scientific则 | 19-020 | 隔离 |
无菌移液管 | Fisher Scientific则 | 9962 | 隔离 |
胶原酶 | 沃辛顿 | CLS2 | 隔离 |
聚四氟乙烯棒直径1 / 4英寸 | 麦克马斯特 - 卡尔 | 8546K11 | 模具的一部分 |
聚四氟乙烯管的1 / 4英寸的ID,1 / 2英寸外径 | 麦克马斯特 - 卡尔 | 8547K31 | 模具的一部分 |
硅胶O型圈1 / 4英寸内径,1 / 2英寸外径 | 麦克马斯特 - 卡尔 | 9396K204 | 模具的一部分 |
聚四氟乙烯管的1 / 4英寸内径,5 / 16英寸外径 | 麦克马斯特 - 卡尔 | 52355K14 | 模具的一部分 |
肯德尔monoject注射器6cc | Fisher Scientific则 | 05-561-41 | 模具的一部分 |
BD注射器3CC | Fisher Scientific则 | 309585 | 模具的一部分 |
牛纤维蛋白原 | 西格玛 | F8630 | 构建 |
牛凝血酶 | 西格玛 | T7513 | 构建 |
1 M羟乙基 | 西格玛 | H0887 | 构建 |
氯化钠 | 西格玛 | S7653 | 构建 |
DMEM培养液 | Invitrogen公司 | 10569 | 构建 |
聚醚F - 127 | 西格玛 | P2443 | 构建 |
氯化钙 | 西格玛 | 383147 | 构建 |
0.2微米的过滤器 | Fisher Scientific则 | SCGVT05RE | 构建 |
40微米的细胞过滤器 | Fisher Scientific则 | 22-363-547 | 构建 |
0.45微米瓶顶部过滤器 | 康宁 | 430627 | 构建 |
玻璃预过滤器 | Millipore公司 | AP2007500 | 构建 |
18G的1 / 2英寸长针 | Fisher Scientific则 | 14 - 826 - 5D | 构建 |
21G 1寸毫针 | Fisher Scientific则 | 14 - 826C | 构建 |
构建罐 | Fisher Scientific则 | 2116 | 构建 |
青霉素链霉素 | Invitrogen公司 | 15140 | 媒体 |
马血清 | 西格玛 | H1138 | 媒体 |
胎牛血清 | Invitrogen公司 | 16000 | 媒体 |
氨基己酸 | Acros Organics公司 | 103305000 | 媒体 |
抗坏血酸的 | 西格玛 | A5960 | 媒体 |
胰岛素 | 西格玛 | I9278 | 媒体 |
多聚甲醛,16% | 电子显微镜科学 | 15710 | 组织学 |
最佳切削温度(OCT) | 特德佩拉 | 27050 | 组织学 |
2 - 甲基丁烷 | 费舍尔 | 03551-4 | 组织学 |
鼠标MYH1/2/4/6初级抗体 | 圣克鲁斯生物技术 | SC - 32732 | 组织学 |
兔连接蛋白43抗体 | 细胞信号技术 | 3512 | 组织学 |
Dylight 549标记的驴抗鼠二抗 | 杰克逊ImmunoResearch实验室 | 715-505-151 | 组织学 |
Dylight 488 -共轭Donke抗兔二抗 | 杰克逊ImmunoResearch实验室 | 711-485-152 | 组织学 |
活/死检测 | Invitrogen公司 | L - 3224 | 分析 |
请求许可使用此 JoVE 文章的文本或图形
请求许可This article has been published
Video Coming Soon
版权所属 © 2025 MyJoVE 公司版权所有,本公司不涉及任何医疗业务和医疗服务。