لذا فإن بحثنا يتعلق بالتكيفات البكتيرية مع الحد من الزنك التي تتجاوز مجرد الحفاظ على الزنك. لذلك نستخدم البكتيريا المسببة للأمراض، المتفطرة السلية، والمتفطرة اللطاخية غير المسببة للأمراض، من أجل معرفة كيف يؤثر الحد من الزنك على أشياء مثل فسيولوجيا البكتيريا والتسبب في المرض. شيء آخر نهتم به هو البروتينات الريبوزومية البديلة ، والتي يتم التعبير عنها بواسطة العديد من البكتيريا أثناء الحد من الزنك ، لكننا ما زلنا لا نعرف الكثير عنها.
أظهرت كل من البكتيريا الفطرية المسببة للأمراض وغير المسببة للأمراض استجابات كبيرة لمحدودية الزنك مع مستويات التعبير في مئات الجينات والبروتينات المتأثرة بتوافر المغذيات الدقيقة للزنك. من الناحية الفسيولوجية ، ينتج عن هذا تشكل عميق للمتفطرة اللطاخية واستجابة الإجهاد التأكسدي بشكل كبير في كل من المتفطرة اللطاخية والمتفطرة السلية المسببة للأمراض. يعالج هذا البروتوكول صعوبة التكاثر وتوحيد شروط النمو الذي يحد من الزنك في إنتاج الريبوسومات البديلة النشطة ترجميا في البكتيريا الفطرية.
لاحظنا عوامل خارجة عن سيطرتنا ، مثل حدث هطول أمطار غزيرة ، مرتبطة بتلوث الزنك وإعداد الوسائط المحدودة للزنك. يضمن النمط الظاهري للمؤشر الحيوي المعروض هنا استنساخ نتائج النمو التي تحد من الزنك. يسمح النمط الظاهري للمؤشر الحيوي القابل للقياس الكمي الموصوف هنا بتحقيق ظروف الحد من الزنك دون استخدام عوامل مخلبية.
لذلك ، فإنه يتيح الإنتاج الموحد للريبوسومات البديلة النشطة ترجميا والتطبيقات النهائية مثل البلاعم أو الالتهابات الحيوانية لدراسة تفاعلات المضيف لمسببات الأمراض. لذلك يعمل مختبرنا على فهم الوظائف المحددة لكل بروتين ريبوسومي بديل وكيف يمكن أن يؤثر دمج هذه البروتينات في الريبوسومات على الترجمة. ونحاول أيضا معرفة ما إذا كانت النتائج التي نراها في M.smegmatis يمكن تطبيقها على MTB أيضا ، وما إذا كان يمكن استخدامها لتطوير علاجات أفضل للسل.
للبدء ، أضف خمسة ملليلتر من وسط 7H9-ADC إلى أنبوب مفاعل حيوي سعة 50 مل. ثم أضف 10 ميكرولترات من خلايا مخزون الجلسرين المذابة من المتفطرة اللطاخة ، وقم بربط الغطاء على الأنبوب. ضع الأنبوب بإحكام بزاوية 45 درجة تقريبا واحتضانه عند 37 درجة مئوية مع 120 دورة في الدقيقة لمدة 18 ساعة.
بعد الحضانة ، قم بقياس الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر وتأكد من أنها حوالي 0.5 إلى 0.8. الطرد المركزي الثقافة عند 3000 × جم لمدة خمس دقائق. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في خمسة ملليلتر من الوسائط المحدودة بالزنك ، أو ZLM.
أثناء الطرد المركزي ، قم بتعقيم الكوفيت عن طريق ملئه بنسبة 70٪ من الإيثانول حتى يفيض ، واتركه لمدة 10 دقائق. ثم اشطف الكوفيت ثلاث مرات باستخدام ZLM. بعد الطرد المركزي النهائي ، أعد تعليق بيليه الخلية في ملليلترين من ZLM.
قم بإفراغ مقياس الطيف الضوئي باستخدام 600 ميكرولتر من ZLM في كوفيت. انقل 600 ميكرولتر من الخلايا المغسولة إلى الكوفيت المعقم وقم بقياس الامتصاص عند 600 نانومتر. إذا كانت الكثافة الضوئية أعلى من واحد ، فاستخدم الصيغة المحددة.
لحساب حجم ZLM المراد إضافته إلى 600 ميكرولتر من الخلايا المغسولة في الكوفيت للحصول على كثافة بصرية واحدة ، أضف الحجم المحسوب ل ZLM إلى الكوفيت. تخلط جيدا عن طريق سحب العينات من خمس إلى 10 مرات وإعادة قياس الامتصاص. بعد ذلك ، أضف 50 مل من ZLM إلى قارورة Erlenmeyer البلاستيكية المعقمة والمزدوجة المعقمة سعة 250 مل.
قم بتلقيح القوارير بإضافة 50 ميكرولترا من المزرعة المعدلة إلى كثافة بصرية واحدة من الكوفيت. بالنسبة للوسائط المليئة بالزنك ، أضف 30 ميكرولترا من كبريتات الزنك 10 ملليمولار لتحقيق تركيز نهائي يبلغ ستة ميكرومولار. احتضان المزرعة عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز 100 دورة في الدقيقة لمدة ثلاثة أيام للوصول إلى المرحلة الثابتة.
في كل يوم من أيام النمو ، أضف 200 ميكرولتر من الثقافة في صفيحة مسطحة القاع ذات 96 بئرا وقم بقياس مقاييس النمو على قارئ صفيحة أحادية اللون. للإبلاغ عن كثافة الخلية التي تم الحصول عليها من قارئ لوحة دقيقة، قم بإنشاء منحنى قياسي لتحويل القراءة من طول المسار باستخدام حجم محدد إلى طول مسار قياسي يبلغ سنتيمترا واحدا. اضبط الطول الموجي للإثارة على 420 نانومتر والانبعاث عند 475 نانومتر لقياس مضان العامل المساعد F420.
ثم اضبط الطول الموجي للإثارة على 375 نانومتر والطول الموجي للانبعاث على 475 نانومتر لقياس مضان الخلفية. قم بإنشاء مسح شدة التألق من الإثارة عند 230 نانومتر إلى 440 نانومتر في خمس خطوات نانومتر ، مع انبعاث ثابت عند 475 نانومتر. باستخدام المعادلة التالية ، احسب النسبة المئوية لشدة التألق عند 375 نانومتر إلى 420 نانومتر.
بعد ثلاثة أيام ، لتسجيل طول الخلية ، قم بتنظيف شريحة زجاجية وقم بتغطية الانزلاق بمنديل خال من النسالة. ماصة قطرة 10 ميكرولتر من الثقافة على الشريحة ووضع زلة الغطاء. اضغط برفق على زلة الغطاء حتى تنتشر المزرعة لملء المنطقة بأكملها تحتها تقريبا.
باستخدام مجهر مركب مع غمر الزيت 100X وأهداف العين 10X مع مرفق الكاميرا ، تصور الشريحة المعدة. التقط صورا للمناطق ذات الخلايا المتعددة التي تكون في بؤرة التركيز في المستوى ولا تتحرك. باستخدام نفس المجهر والهدف ، قم بتصوير شريحة معايرة.
في برنامج فيجي، حدد أداة الخط المستقيم وارسم خطا عبر طول شريحة المعايرة. حدد تحليل، متبوعا بتعيين المقياس وأدخل المسافة المعروفة في الوحدة لشريط المقياس. ثم حدد عالمي لتطبيق المقياس على جميع الصور والقياسات.
الآن افتح الصورة واستخدم أداة الخط المستقيم لرسم خط على طول الخلية لقياسها. انسخ بيانات طول الخلية من النافذة المنبثقة إلى جدول بيانات أو احفظها كملف قيمة مفصول بفواصل للتحليل الإحصائي. أظهرت الثقافات البرية المزروعة في ZLM قيم كثافة ضوئية أقل مقارنة بالوسائط المليئة بالزنك مع سلالات دلتا altRP ذات القيم الأقل.
لوحظ استطالة الخلية في الثقافات البرية ZLM بمتوسط طول خلية يبلغ تسعة ميكرومترات ، بينما كانت الخلايا المليئة بالزنك أقصر عند حوالي ثلاثة ميكرومترات. لم تظهر خلايا دلتا altRP استطالة كبيرة في ظروف محدودة الزنك. أظهرت عمليات المسح الفلوري انخفاضا في مضان العامل المساعد F420 في الثقافات البرية ZLM ، حيث أظهرت سلالات دلتا altRP تباينا أعلى بكثير في التألق.
