따라서 우리의 연구는 아연 보존을 넘어 아연 제한에 대한 박테리아의 적응에 관한 것입니다. 그래서 우리는 병원성 박테리아인 Mycobacterium tuberculosis와 비병원성인 Mycobacterium smegmatis를 사용하여 아연 제한이 박테리아 생리학 및 발병 기전과 같은 것들에 어떤 영향을 미치는지 확인합니다. 우리가 관심을 갖는 또 다른 것은 아연 제한 중에 많은 박테리아에 의해 발현되는 대체 리보솜 단백질이지만 아직 이에 대해 많이 알지 못합니다.
병원성 및 비병원성 마이코박테리아 모두 미량 영양소 아연의 가용성에 영향을 받는 수백 개의 유전자 및 단백질에서 발현 수준으로 아연 제한에 대한 극적인 반응을 보였습니다. 생리학적으로 이는 Mycobacterium smegmatis에 대한 심오한 형태 형성을 초래하고 Mycobacterium smegmatis와 병원성 Mycobacterium tuberculosis 모두에서 산화 스트레스 반응을 크게 상향 조절합니다. 이 프로토콜은 마이코박테리아에서 번역 활성 대체 리보솜 생산에서 아연 제한 성장을 위한 재현 및 표준화의 어려움을 해결합니다.
우리는 폭우와 같이 우리가 통제할 수 없는 요인을 관찰했으며, 이는 아연 오염 및 아연 제한 배지 준비와 상관관계가 있습니다. 여기에 제시된 생물지표 표현형은 아연 제한 성장 결과의 재현성을 보장합니다. 여기에 설명된 정량화 가능한 바이오인디케이터 표현형은 킬레이트제를 사용하지 않고도 아연 제한 조건을 달성할 수 있습니다.
따라서 번역 활성 대체 리보솜의 표준화된 생산과 대식세포 또는 동물 감염과 같은 다운스트림 응용 프로그램을 통해 숙주-병원체 상호 작용을 연구할 수 있습니다. 따라서 우리 연구실은 각 대체 리보솜 단백질의 특정 기능과 이러한 단백질이 리보솜에 통합되는 것이 번역에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 이해하기 위해 노력하고 있습니다. 또한 M.smegmatis에서 볼 수 있는 결과가 MTB에도 적용될 수 있는지, 그리고 더 나은 결핵 치료법을 개발하는 데 사용될 수 있는지도 연구하고 있습니다.
시작하려면 50ml 바이오리액터 튜브에 5ml의 7H9-ADC 배지를 추가합니다. 그런 다음 Mycobacterium smegmatis의 해동된 글리세롤 스톡 세포 10마이크로리터를 추가하고 뚜껑을 튜브에 나사로 고정합니다. 튜브를 약 45도 각도로 단단히 놓고 섭씨 37도에서 120rpm으로 18시간 동안 배양합니다.
배양 후 600나노미터에서 광학 밀도를 측정하고 약 0.5 - 0.8인지 확인합니다. 3000 x g에서 5분 동안 배양물을 원심분리합니다. 상층액을 버리고 펠릿을 5ml의 아연 제한 배지(ZLM)에 재현탁합니다.
원심분리 중에는 큐벳에 70% 에탄올을 채워 넘칠 때까지 살균하고 10분 동안 그대로 둡니다. 그런 다음 ZLM으로 큐벳을 세 번 헹굽니다. 최종 원심분리 후, 세포 펠릿을 2밀리리터의 ZLM에 재현탁합니다.
큐벳에 600마이크로리터의 ZLM을 사용하여 분광 광도계를 비웁니다. 세척된 세포 600마이크로리터를 멸균된 큐벳으로 옮기고 600나노미터에서 흡광도를 측정합니다. 광학 밀도가 1보다 높으면 주어진 공식을 사용하십시오.
광학 밀도 1을 얻기 위해 큐벳에서 세척된 600마이크로리터의 셀에 추가할 ZLM의 부피를 계산하려면 계산된 ZLM 부피를 큐벳에 추가합니다. 5-10회 피펫팅하여 잘 혼합하고 흡광도를 다시 측정합니다. 다음으로, 50ml의 ZLM을 멸균된 이중 오토클레이브 250ml 플라스틱 삼각 플라스크에 추가합니다.
큐벳에서 광학 밀도 1로 조정된 배양액 50마이크로리터를 추가하여 플라스크를 접종합니다. 아연이 풍부한 매체의 경우, 30마이크로리터의 10밀리몰 황산아연을 첨가하여 6마이크로몰의 최종 농도를 달성합니다. 섭씨 37도에서 100rpm 쉐이크로 3일 동안 배양하여 고정상에 도달하도록 배양합니다.
성장이 진행되는 동안 매일 96웰의 평평한 바닥 마이크로플레이트에 200마이크로리터의 배양액을 추가하고 모노크로메이터 마이크로플레이트 리더에서 성장 지표를 측정합니다. 마이크로플레이트 리더에서 얻은 세포 밀도를 보고하려면 표준 곡선을 생성하여 설정된 부피를 사용하는 경로 길이에서 표준 1cm 경로 길이로 판독값을 변환합니다. 여기 파장을 420나노미터로, 방출을 475나노미터로 설정하여 보조인자 F420의 형광을 측정합니다.
그런 다음 여기 파장을 375나노미터로, 방출 파장을 475나노미터로 설정하여 배경 형광을 측정합니다. 230나노미터에서 440나노미터까지의 여기(excitation)에서 5나노미터 단계로 형광 강도 스캔(Fluorescence Intensity Scan)을 생성하며, 475나노미터에서 고정 방출을 수행합니다. 다음 방정식을 사용하여 375나노미터 - 420나노미터에서 형광 강도의 백분율을 계산합니다.
3일 후 세포 길이를 기록하려면 유리 슬라이드를 청소하고 보푸라기가 없는 물티슈로 슬립을 덮습니다. 10마이크로리터의 배양액 방울을 슬라이드에 피펫으로 떨어뜨리고 커버 슬립을 놓습니다. 커버 슬립을 부드럽게 눌러 배양물이 아래 전체 영역을 거의 채울 정도로 퍼집니다.
100X 오일 이멀젼 및 10X 안구 대물렌즈가 있는 복합 현미경을 사용하여 카메라가 부착된 상태에서 준비된 슬라이드를 시각화합니다. 평면에서 초점이 맞춰져 있고 움직이지 않는 여러 셀이 있는 영역의 사진을 찍습니다. 동일한 현미경과 대물렌즈를 사용하여 보정 슬라이드를 이미지화합니다.
Fiji 소프트웨어에서 직선 도구를 선택하고 보정 슬라이드의 길이를 가로질러 선을 그립니다. Analyze(분석)를 선택한 다음 Set Scale(스케일 설정)을 선택하고 스케일 바에 대해 알려진 거리를 단위(단위)로 입력합니다. 그런 다음 전역을 선택하여 모든 이미지와 측정에 스케일을 적용합니다.
이제 이미지를 열고 직선 도구를 사용하여 셀의 길이를 따라 선을 그려 측정합니다. 팝업 창의 셀 길이 데이터를 스프레드시트에 복사하거나 통계 분석을 위해 쉼표로 구분된 값 파일로 저장합니다. ZLM에서 성장한 야생형 배양물은 아연 함유 배지에 비해 광학 밀도 값이 낮았으며, 델타 altRP 균주는 훨씬 더 낮은 값을 가졌습니다.
세포 신장은 평균 세포 길이가 9마이크로미터인 ZLM 야생형 배양에서 관찰된 반면, 아연이 풍부한 세포는 약 3마이크로미터로 더 짧았습니다. 델타 altRP 세포는 아연이 제한된 조건에서 유의한 신장을 보이지 않았습니다. 형광 스캔은 ZLM 야생형 배양에서 보조인자 F420 형광이 감소한 것으로 나타났으며, 델타 altRP 균주는 훨씬 더 높은 형광 변동성을 보였습니다.
