SAS and MGA are supported by Project Grants, a Program Grant and Research Fellowships from the National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC), and by funds from the Operational Infrastructure Support Program provided by the Victorian Government, Australia. MMH has support from a Peter MacCallum Foundation Grant.

متوسط ​​مكيفة WEHI-3D ​​مصدر IL-3 وإعداد ملاحظة: الماوس المحببات خط خلية سرطان الدم WEHI-3D ​​هو مثقف لتوليد المتوسطة مكيفة تحتوي على IL-3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة WEHI-3D ​​في Dulbecco لتعديل المتوسطة النسر (DMEM)، و 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، 1٪ منذ فترة طويلة الحياة الجلوتامين ملحق، 50 ميكروغرام / مل الجنتاميسين. تطعيم 5 × 10 6 الخلايا في مرحلة سجل النمو إلى 50 مل من مستنبت الطازجة في T175 سم 3 الأنسجة قارورة الثقافة وتنمو لمدة 7 أيام أو حتى مرت الخلايا مرحلة سجل نموها بنحو 24 - 48 ساعة (تجنب موت الخلايا المفرط في الثقافة). وسائل الإعلام مكيفة هو قادر على تخزينها لعدة سنوات في -20 درجة مئوية، لذلك دفعات من 200-500 مل يمكن أن تنتج في وقت واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب السوائل والخلايا من قوارير وتدور في 1000 ز س لمدة 15 دقيقة لإزالة الخلايا والبقايا الخلوية. إزالة أعلى 90٪ من supernatant. تصفية من خلال وحدة 0.22 ميكرون فلتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة WEHI-3D ​​المتوسطة مكيفة (CM) في 1 مل و 50 مل و 200 مل مجلدات لتخزين في -20 درجة مئوية أو -70 درجة مئوية. قسامات أصغر مفيدة لإعداد مقايسة، كميات متوسطة لصنع مستنبت لمرور خطوط الخلايا التي تعتمد على عامل، وكميات أكبر للتخزين على المدى الطويل. IL-3 غير مستقرة نسبيا في 4 درجات مئوية ويمكن تخزين المتوسطة إذابة ذلك لبضعة أسابيع إذا ما استخدمت تحت ظروف معقمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدلا من ذلك، استخدم الماوس المؤتلف IL-3 عند مستويات 50 نانوغرام / مل المخفف في مستنبت، بعد أن تمت تصفيتها من خلال وحدة 0.22 ميكرون فلتر. </li></ol> 2. الثقافة وتقييم VEGFR-2-EpoR با / F3 وتحكم با خطوط خلية / F3 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سيطرة ثقافة خلايا با / F3 في DMEM، و 10٪ FBS، 50 ميكروغرام / مل الجنتاميسين أو البنسلين / تكملة الستربتومايسين، 1٪ واستقرت L-الجلوتامين و 10٪ WEHI-3D-CM. خلايا مرور في 1:15 التخفيفات حول كل ثلاثة أيام من خلايانموا في مرحلة السجل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة الخلايا VEGFR2-EpoR با / F3 في DMEM، و 10٪ FBS، 50 ميكروغرام / مل الجنتاميسين، استقرت 1٪ L-الجلوتامين و 10٪ WEHI-3D-CM و 1 ملغ / مل G418. خلايا مرور في 1:15 التخفيفات من نمو الخلايا في مرحلة السجل. انظر 24 لمزيد من التفاصيل حول بناء والتعبير عن مستقبلات خيالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السيطرة الحصاد با / F3 أو VEGFR2-EpoR با خلية / F3 من الثقافات منتصف السجل المرحلة. ماصة بلطف لإزالة هذه الخلايا غير ملتصقة من أسفل القارورة. يغسل ثلاث مرات في الماوس تحظرب الفوسفات مخزنة المالحة، ودرجة الحموضة 7.3 (PBS)، (10 مل، الطرد المركزي في 750 ز س لمدة 5 دقائق لاسترداد بيليه الخلية) لإزالة المتوسط ​​تحتوي IL-3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل خلايا مرة واحدة مع DMEM ومواد مضافة، من دون WEHI-3D-CM أو IL-3 المؤتلف، ثم resuspend في هذه الوسيلة عند تركيز 7.4 × 10 4 خلية / مل (أي 1000 خلية لكل 13.5 ميكرولتر، 10000 خلايا لكل 135 ميكرولتر على النحو الذي يحدده العد باستخدام عدادة الكريات) لاستخدام في الإصدارات شبه الكمية أو الكمية للفحص على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقييم الخلايا للجدوى من الاستبعاد التريبان الأزرق (تنبيه). مزيج التريبان الأزرق في برنامج تلفزيوني (0.4٪) 1: 1 مع السكان الخلية وعدد لا يقل عن 100 الخلايا على عدادة الكريات. وتعتبر الخلايا التي تناول الصبغة القتلى أو الموت. مطلوب بقاء أكبر من 98٪ إلى إجراء فحص. </li></ol> 3. الفحص شبه الكمية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة خلايا غسلها (1000 خلايا) الواردة في 13.5 ميكرولتر من المتوسطة IL-3-نقص في الآبار لوحة microwell 72-جيدا في RT. الحرص على خلط تعليق خلية خلال aliquotting لضمان تصفية خلية عن طريق الجاذبية لا تركيز خلية التحيز. استخدام معايرة جيدا P20 الآلي ماصة، ونصائح تعقيمها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة عينات الاختبار والضوابط إلى الآبار في حجم 10٪ (1.5 ميكرولتر، مما يجعل الحجم النهائي من 15 ميكرولتر تحتوي على 1000 خلية لكل جيدا) باستخدام ماصة P20 معايرة أو من الأفضل، P2 ماصة. خذ كاليفورنياإعادة لضمان أن عينات متوافقة مع الظروف الثقافة لخلايا با / F3 من حيث درجة الحموضة والملح وغيرها من المواد التي لها تأثير السامة للخلايا / تثبيط الخلايا. حيثما كان ذلك ممكنا، واستخدام وسيلة متوافق أو المخزن المؤقت (على سبيل المثال، DMEM أو برنامج تلفزيوني، على التوالي) أو تمييع هذه الوسائط أو العازلة. سوف سحن مع نفس الطرف ضمان خلط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لعينات السيطرة، وتشمل (ط) متوسطة وحدها تحتوي على أي IL-3؛ (ب) وأضاف WEHI-3BD-CM والمتوسطة وحدها في الحجم النهائي 10٪. و / أو (ج) VEGF-A تضعف إلى 100 نانوغرام / مل في المتوسط ​​وحده، لا تحتوي على IL-3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء أي الآبار غير المستخدمة من لوحة microwell مع الماء المعقم، في برنامج تلفزيوني أو المتوسطة ووضع لوحة داخل حاوية ترطيب (مع الماء المنقوع المناديل الورقية) مما يسمح بتبادل الغازات. احتضان الخلايا داخل حاويات في جو مرطب من 10٪ CO 2. هذا الاختبار يمكن تعيين مريح يصل في 3 ساعات قبل شخص واحد إذا هي عينات الاختبار ومكوناته وسائل الإعلام المتاحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقييم لوحات عادة بعد 16 ساعة منحضانة الذي التمييز الوقت بين العينات الإيجابية والسلبية واضح. انظر الشكل 3 للحصول على أمثلة من كيفية ظهور الخلايا في الثقافة. تحليل لوحات باستخدام معيار مقلوب المجهر على النقيض من المرحلة في 40-100 × التكبير. ملاحظة: ويلز التي تحتوي على عوامل النمو الداعمة مثل IL-3 أو VEGF-A وتحتوي على خلايا التي تظهر جولة وشفافة. سوف الآبار دون عوامل النمو الداعمة أو مع المتوسط ​​وحده قد خفضت أعداد الخلايا المستديرة، وكذلك الخلايا الميتة أو التي تحتضر والحطام الخلوي (على سبيل المثال، الشكل 3C). تقييم الفحص في 24-48 ساعة بعد الحضانة هو الأمثل للحساسية. </li></ol> 4. الكمية الأحيائي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة خلايا غسلها (10،000 الخلايا في 135 ميكرولتر) في IL-3-نقص المتوسطة إلى الآبار لوحة microtiter 96-جيدا القياسية في RT. الحرص على خلط تعليق خلية خلال aliquotting لضمان تصفية خلية عن طريق الجاذبية لا يؤثر متركيز ليرة لبنانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة عينات الاختبار والضوابط إلى الآبار في حجم 10٪ (15 ميكرولتر) باستخدام ماصة معايرة (P20). الحرص على التأكد من أن عينات متوافقة مع الظروف الثقافة لخلايا با / F3 من حيث درجة الحموضة أو الملح أو غيرها من المواد السامة للخلايا يحتمل أن تكون / تثبيط الخلايا. حيثما كان ذلك ممكنا، واستخدام وسيلة متوافق أو المخزن المؤقت (على سبيل المثال، DMEM أو برنامج تلفزيوني) أو تمييع هذه الوسائط أو العازلة. فلتر تعقيم كميات صغيرة باستخدام 0.22 ميكرون المسام خلات السليلوز أنبوب الطرد المركزي تصفية وحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان خليط من الخلايا، عوامل النمو و / أو المانع وكلاء في جو مرطب من 10٪ CO 2 لمدة 48 ساعة. إجراء فحص داخل حاوية مرطب يحتوي على المناديل الورقية غارقة في المياه وتسمح الغاز الصرف. عند الانتهاء من فترة الحضانة، وتقييم الفحص باستخدام إحدى الطرق البديلة المدرجة أدناه والتي هي علامات بديلة من عدد الخلايا قابلة للحياة في البئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البديل رقم 1: 3 H-thymidiشمال شرق التأسيس ملاحظة: تم تصميم هذا القياس الكمي لتنسيق لوحة 96-جيدا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد مرور فترة الحضانة لوحات فحص لمدة 48 ساعة على 37 درجة مئوية (حجم 150 ميكرولتر لكل بئر)، إضافة 3 H-الثيميدين في حجم 50 ميكرولتر من المتوسطة فحص (با / F3 الثقافة وسيط وبدون IL-3 / WEHI-3D ​​CM) لكل بئر بتركيز 20 μCi / مل، وإعطاء الجرعة النهائية من 1 μCi لكل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحات ل4 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية قبل حصاد الخلايا باستخدام حصادة الخلية. استخراج عينات فردية عن طريق وضع المرشحات في scintillant وقياس مع السائل التلألؤ عداد. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البديل رقم 2: كشف ضوء بارد من الخلوية ATP ملاحظة: يستخدم هذا النهج كاشف مراقبة ATP التي عند دمجها مع الخلايا المحللة يمكن أن تولد إشارة تلألؤ بيولوجي الذي يعكس خلايا قابلة للحياة في عدد السكان. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا ليز لاستخراج ATP واستخدام كاشف رصد اعبي التنس المحترفين لتوليدإشارة الانارة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. قراءة التألق باستخدام luminometer متوافق مع شكل لوحة 96-جيدا. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البديل رقم 3: الحد الأنزيمية لصبغ المؤشر من قبل خلايا قابلة للحياة ملاحظة: فحوصات ريسازورين مقرها تظهر علاقة جيدة لبقاء الخلية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجمع بين الخلايا المستزرعة مع صبغ أساس ريسازورين وتحديد فحوصات باستخدام قارئ لوحة مضان وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Ferrara, N., Gerber, H. P., LeCouter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+VEGF+and+its+receptors.">The biology of VEGF and its receptors.</a> Nat Med. 9, 669-676 (2003).</li><li>Achen, M. G., Stacker, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor-D:signalling+mechanisms,+biology+and+clinical+relevance.">Vascular endothelial growth factor-D:signalling mechanisms, biology and clinical relevance.</a> Growth Factors. 5, 283-296 (2012).</li><li>Ferrara, N., Mass, R. D., Campa, C., Kim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+VEGF-A+to+treat+cancer+and+age-related+macular+degeneration.">Targeting VEGF-A to treat cancer and age-related macular degeneration.</a> Annu Rev Med. 58, 491-504 (2007).</li><li>Ferrara, N., Hillan, K. J., Gerber, H. P., Novotny, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+development+of+bevacizumab,+an+anti-VEGF+antibody+for+treating+cancer.">Discovery and development of bevacizumab, an anti-VEGF antibody for treating cancer.</a> Nat Rev Drug Discov. 3, 391-400 (2004).</li><li>Korpelainen, E. I., Alitalo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+angiogenesis+and+lymphangiogenesis.">Signaling angiogenesis and lymphangiogenesis.</a> Curr Opin Cell Biol. 10, 159-164 (1998).</li><li>Senger, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+cells+secrete+a+vascular+permeability+factor+that+promotes+accumulation+of+ascities+fluid.">Tumour cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascities fluid.</a> Science. 219, 983-985 (1983).</li><li>Joukov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+vascular+endothelial+growth+factor,+VEGF-C,+is+a+ligand+for+the+Flt-4+(VEGFR-3)+and+KDR+(VEGFR-2)+receptor+tyrosine+kinases.">A novel vascular endothelial growth factor, VEGF-C, is a ligand for the Flt-4 (VEGFR-3) and KDR (VEGFR-2) receptor tyrosine kinases.</a> EMBO J. 15, 290-298 (1996).</li><li>Achen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+D+(VEGF-D)+is+a+ligand+for+the+tyrosine+kinases+VEGF+receptor+2+(Flk1)+and+VEGF+receptor+3+(Flt4).">Vascular endothelial growth factor D (VEGF-D) is a ligand for the tyrosine kinases VEGF receptor 2 (Flk1) and VEGF receptor 3 (Flt4).</a> Proc Natl Acad Sci USA. 95, 548-553 (1998).</li><li>Leppanen, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+determinants+of+vascular+endothelial+growth+factor-D+receptor+binding+and+specificity.">Structural determinants of vascular endothelial growth factor-D receptor binding and specificity.</a> Blood. 117, 1507-1515 (2011).</li><li>Wise, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+(VEGF)-like+protein+from+orf+virus+NZ2+binds+to+VEGFR2+and+neuropilin-1.">Vascular endothelial growth factor (VEGF)-like protein from orf virus NZ2 binds to VEGFR2 and neuropilin-1.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 3071-3076 (1999).</li><li>Yamazaki, Y., Takani, K., Atoda, H., Morita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snake+venom+vascular+endothelial+growth+factors+(VEGFs)+exhibit+potent+activity+through+their+specific+recognition+of+KDR+(VEGF+receptor+2).">Snake venom vascular endothelial growth factors (VEGFs) exhibit potent activity through their specific recognition of KDR (VEGF receptor 2).</a> J Biol Chem. 278, 51985-51988 (2003).</li><li>Stacker, S. A., Achen, M. G., Jussila, L., Baldwin, M. E., Alitalo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphangiogenesis+and+cancer+metastasis.">Lymphangiogenesis and cancer metastasis.</a> Nat Rev Cancer. 2, 573-583 (2002).</li><li>Stacker, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-D+promotes+the+metastatic+spread+of+tumor+cells+via+the+lymphatics.">VEGF-D promotes the metastatic spread of tumor cells via the lymphatics.</a> Nat Med. 7, 186-191 (2001).</li><li>Skobe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+tumor+lymphangiogenesis+by+VEGF-C+promotes+breast+cancer+metastasis.">Induction of tumor lymphangiogenesis by VEGF-C promotes breast cancer metastasis.</a> Nat Med. 7, 192-198 (2001).</li><li>Mandriota, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor-C-mediated+lymphangiogenesis+promotes+tumour+metastasis.">Vascular endothelial growth factor-C-mediated lymphangiogenesis promotes tumour metastasis.</a> EMBO J. 20, 672-682 (2001).</li><li>Stacker, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphangiogenesis+and+lymphatic+vessel+remodelling+in+cancer.">Lymphangiogenesis and lymphatic vessel remodelling in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 14, 159-172 (2014).</li><li>Karnezis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-D+promotes+tumor+metastasis+by+regulating+prostaglandins+produced+by+the+collecting+lymphatic+endothelium.">VEGF-D promotes tumor metastasis by regulating prostaglandins produced by the collecting lymphatic endothelium.</a> Cancer Cell. 21, 181-195 (2012).</li><li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis:+an+organizing+principle+for+drug+discovery.">Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 6, 273-286 (2007).</li><li>Stacker, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+vascular+endothelial+growth+factor-D+involves+proteolytic+processing+which+generates+non-covalent+homodimers.">Biosynthesis of vascular endothelial growth factor-D involves proteolytic processing which generates non-covalent homodimers.</a> J Biol Chem. 274, 32127-32136 (1999).</li><li>McColl, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmin+activates+the+lymphangiogenic+growth+factors+VEGF-C+and+VEGF-D.">Plasmin activates the lymphangiogenic growth factors VEGF-C and VEGF-D.</a> J Exp Med. 198, 863-868 (2003).</li><li>Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+human+endothelial+cells+derived+from+umbilical+veins.+Identification+by+morphologic+and+immunologic+criteria.">Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria.</a> J Clin Invest. 52, 2745-2756 (1973).</li><li>Shibuya, M., Claesson-Welsh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+by+VEGF+receptors+in+regulation+of+angiogenesis+and+lymphangiogenesis.">Signal transduction by VEGF receptors in regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis.</a> Exp Cell Res. 312, 549-560 (2006).</li><li>Pacifici, R. E., Thomason, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+tyrosine+kinase/cytokine+receptors+transmit+mitogenic+signals+in+response+to+ligand.">Hybrid tyrosine kinase/cytokine receptors transmit mitogenic signals in response to ligand.</a> J Biol Chem. 269, 1571-1574 (1994).</li><li>Stacker, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mutant+form+of+vascular+endothelial+growth+factor+(VEGF)+that+lacks+VEGF+receptor-2+activation+retains+the+ability+to+induce+vascular+permeability.">A mutant form of vascular endothelial growth factor (VEGF) that lacks VEGF receptor-2 activation retains the ability to induce vascular permeability.</a> J Biol Chem. 274, 34884-34892 (1999).</li><li>Davydova, N., Roufail, S., Streltsov, V. A., Stacker, S. A., Achen, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+VD1+neutralizing+antibody+to+vascular+endothelial+growth+factor-D:+binding+epitope+and+relationship+to+receptor+binding.">The VD1 neutralizing antibody to vascular endothelial growth factor-D: binding epitope and relationship to receptor binding.</a> J Mol Biol. 407, 581-593 (2011).</li><li>Wise, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vascular+endothelial+growth+factors+vary+extensively+in+amino+acid+sequence,+receptor-binding+specificities,+and+the+ability+to+induce+vascular+permeability+yet+are+uniformly+active+mitogens.">Viral vascular endothelial growth factors vary extensively in amino acid sequence, receptor-binding specificities, and the ability to induce vascular permeability yet are uniformly active mitogens.</a> J Biol Chem. 278, 38004-38014 (2003).</li><li>Davydova, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+human+vascular+endothelial+growth+factor-D+for+structural+and+preclinical+therapeutic+studies.">Preparation of human vascular endothelial growth factor-D for structural and preclinical therapeutic studies.</a> Protein Expr. Purif. 82, 232-239 (2012).</li><li>Baldwin, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+forms+of+mouse+vascular+endothelial+growth+factor-D+are+generated+by+RNA+splicing+and+proteolysis.">Multiple forms of mouse vascular endothelial growth factor-D are generated by RNA splicing and proteolysis.</a> J. Biol. Chem. 276, 44307-44314 (2001).</li><li>Baldwin, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+specificity+of+receptor+binding+by+vascular+endothelial+growth+factor-D+is+different+in+mouse+and+man.">The specificity of receptor binding by vascular endothelial growth factor-D is different in mouse and man.</a> J. Biol. Chem. 276, 19166-19171 (2001).</li><li>Makinen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+lymphatic+endothelial+cells+transduce+growth,+survival+and+migratory+signals+via+the+VEGF-C/D+receptor+VEGFR-3.">Isolated lymphatic endothelial cells transduce growth, survival and migratory signals via the VEGF-C/D receptor VEGFR-3.</a> EMBOJ. 20, 4762-4773 (2001).</li><li>Achen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+to+vascular+endothelial+growth+factor-D+block+its+interactions+with+both+VEGF+receptor-2+and+VEGF+receptor-3.">Monoclonal antibodies to vascular endothelial growth factor-D block its interactions with both VEGF receptor-2 and VEGF receptor-3.</a> Eur J Biochem. 267, 2505-2515 (2000).</li><li>Bamford, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+COSMIC+(Catalogue+of+Somatic+Mutations+in+Cancer)+database+and+website.">The COSMIC (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer) database and website.</a> Br J Cancer. 91, 355-358 (2004).</li><li>Pleasance, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+catalogue+of+somatic+mutations+from+a+human+cancer+genome.">A comprehensive catalogue of somatic mutations from a human cancer genome.</a> Nature. 463, 191-196 (2010).</li></ol>

ستيفن الشوكة ومارك م Achen هي المساهمين في الساعة البيولوجية للتكنولوجيا المحدودة، وهي شركة تطوير العلاجات التي تستهدف الأسرة VEGF من عوامل النمو.

مقايسة الموصوفة هنا يعتمد على استخدام خلايا الجدوى العالية، والتي تعتمد على عوامل النمو. لذا الخلايا تحتاج إلى أن تكون تربيتها بعناية للتأكد من أنها تعتمد على عامل، والاحتفاظ بها التعبير عن مستقبلات خيالية. ضمان المتوسطة وتقدم طازجة وليس تخزينها لفترة طويلة للغاية?...

عائلة عامل النمو البطاني الوعائي (VEGF) من عوامل النمو بروتين يفرز والمشابهة مستقبلات سطح الخلية التي هي مجموعة هامة ومتنوعة من بروابط القابلة للذوبان ومستقبلات جزءا لا يتجزأ من غشاء، على التوالي أن وظيفة في transducing إشارات عبر الأغشية الخلوية. أنها تعمل بشكل رئيسي في الخلايا البطانية ولكن أيضا في خلايا المنشأ الظهارية وتلك من 1،2 الجهاز المناعي. مسارات الإشارات تعمل بواسطة مستقبلات تنشيط يجند VEGF (VEGFRs) تعتبر بالغة الأهمية في الأمراض الرئيسية، مثل التنكس البقعي المرتبط بالعمر والسرطان، والعلاجات التي تستهدف منهم في الاستخدام السريري المتكرر (على سبيل المثال، فإن الأجسام المضادة بيفاسيزوماب وحيدة النسيلة الذي يستهدف VEGF-A) 3،4. واحدة من تعقيدات الأسرة VEGF هو تنوع بروابط القابلة للذوبان الموجودة في الطبيعة (VEGF-A، VEGF-B، VEGF-C، VEGF-D، والبروتينات عامل نمو بطانة الاوعية المشفرة بواسطة ORF parapox عائلة الفيروسات وسم الأفعى VEGF، بالإضافة إلى الآخر مكبحالإسوية من VEGF-A) 2. هذه بروابط تتفاعل مع ثلاثة من أفراد عائلة مستقبلات التيروزين كيناز، وهي VEGFR-1، VEGFR-2 وVEGFR-3. يتم التعبير عن هذه المستقبلات بنسب مختلفة على أنواع مختلفة من الخلايا ولكن غالبا ما تشارك في أعربت على سطح الخلايا البطانية التي تبطن الأوعية الدموية واللمفاوية من جميع الأحجام 5. VEGFR-2 يمكن ربط الثدييات بروابط VEGF-A 6، VEGF-C 7 و VEGF-D 8،9 وكذلك فيروس ORF VEGF 10 و سم الأفعى VEGF 11. VEGFR-2 يلعب دورا رئيسيا في دفع عجلة الأوعية الدموية (نمو أوعية دموية جديدة من الأوعية الموجودة مسبقا) في التطور الجنيني، التئام الجروح والسرطان وأمراض العيون. في هذه السياقات، بروابط مثل VEGF-A، -C و-D ربط وتفعيل مستقبلات على خلايا الدم بطانة الأوعية الدموية 12-15. على الخلايا البطانية اللمفاوية، يلعب VEGFR-2 دورا في lymphangiogenesis، وتشكيل الأوعية اللمفاوية الجديدة 16. VEGFR-2 يمكن أيضا أن تعزز تمدد وتوسع الشرايين والأوعية اللمفاوية الرئيسية في الأنسجة السليمة ومرض 17. فهم كامل من VEGFR-2: التفاعلات يجند غير ذلك من المهم لتطوير مثبطات لاستخدامها في علاج الأمراض التي تعتمد على الأوعية الدموية 18. في حين أن معظم الأشكال الإسوية من VEGF-A ربط لVEGFR-2، مطلوب انشقاق بروتين عامل نمو بطانة الاوعية-C وVEGF-D لاطلاق سراح جزء يتكون من المجال VEGF-التماثل التي يسلك قابلية عالية ملزما للVEGFR-2 19،20. لقد قمنا بتطوير الأحيائي لمراقبة بروابط من VEGFR-2 التي تم تصميمها للتحايل على الحاجة إلى الخلايا الأولية البطانية، والتي يصعب من الناحية الفنية لمرور، ومكلفة لشراء والثقافة (التي تتطلب المتوسطة المتخصصة) 21 والتعبير عن VEGFRs متعددة والمشارك المرتبطة مستقبلات 22. Heterodimerization من VEGFR-2 مع مستقبلات عامل نمو بطانة الاوعية أخرى أو شارك في مستقبلات يمكن أن يسبب التعقيدات غير المرغوب فيه عندما تهدف إلى مسمارالتفاعلات ذ الثنائية مستقبلات يجند، وتقييم النشاط تعزى إلى مستقبلات محددة، أو تقييم أثر الكواشف المثبطة. 23. الأحيائي يحتفظ تنقل مستقبلات ذات الصلة في غشاء الخلية ويسمح تقييم قدرة يجند لربط وصلة عبر المنطقة خارج الخلية VEGFR-2. يعتمد الأحيائي على خلق مستقبل خيالية في الذي تنصهر المنطقة خارج الخلية من مستقبلات عامل نمو بطانة الاوعية (في هذه الحالة VEGFR-2) إلى الغشاء والمناطق داخل الخلايا مستقبلات الإريثروبويتين (EpoR)، وهو عضو في عائلة مستقبلات خلوى 8،24. ثم يتم التعبير عن هذا البروتين الانصهار في خط خلية للمحترفين-B التي تعتمد على عامل با / F3، التي التحفيز مع يجند قادرة على ربط وعبر ربط المجال خارج الخلية من مستقبلات يسبب تنشيط المنطقة المستجيب حشوية، والتي هي قادرة على من transducing إشارة البقاء على قيد الحياة عن طريق يانوس تحركات (JAKs) لتعزيز خليةالبقاء على قيد الحياة و / أو انتشار الأسلحة النووية. في المقابل، تعبيرا عن كامل طول VEGFR-2 في نفس نوع من الخلايا، والتحفيز مع يجند، لا تعزز بقاء الخلايا وانتشار، مشيرا إلى أن المؤثرات الإشارات القريبة من مسار VEGFR-2 غير متوفرة في هذا نوع من الخلايا. وقد استخدمنا الفحص في مجموعة متنوعة من السياقات لاستكشاف ملزمة من رواية VEGFR-2 بروابط 10،19،20،24-29. في توليفة مع VEGFR-3-EpoR با / F3 فحص ذلك قمنا بالمقارنة أنشطة النسبية للVEGF-C وعوامل النمو VEGF-D للربط وعبر ربط VEGFR-2 وVEGFR-3 30. وقد استخدم الاختبار لتميز النشاط المثبطة من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة لVEGFR-2 أو VEGF-D، قابل للذوبان VEGFR-2 فخ وpeptidomimetics التي تستهدف الأسرة VEGF 31. تم استخدام الفحص أيضا لإظهار قدرة VEGFs من مختلف سلالات فيروس ORF إلى ربط وعبر رابط VEGFR-2 قبل الاختبار في الخلايا البطانية الابتدائية <sتصل&gt; 10،26. الفحص مفيد بشكل خاص للفحص السريع للالمسوخ من VEGFs التي يمكن تقييمها بسرعة للنشاط قبل أن يتم إدخالها إلى أكثر شاقة المقايسات خلية البطانية 25 أو عندما بروتوكولات تقييم للنمو تنقية عوامل 27. مقايسة وصفنا من السهل القيام بها، ونسخة شبه الكمي يسمح للقرارات سريعة مطلوبة في بعض الأحيان عندما مراقبة الإنتاج أو تنقية عوامل النمو، والأجسام المضادة أو المجالات مستقبلات للذوبان لتجارب أخرى. سهولة الاستخدام للمقايسة يجعلها عنصرا مكملا مثاليا لإجراء المزيد من الدراسات وأكثر اكتمالا القيام بها مع الخلايا البطانية الأولية المشتقة من الدم أو الأوعية اللمفاوية من أنسجة معينة أو أجهزة الجسم.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1110">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">T8154</td>
			<td style="width:424px;">0.4% solution in PBS is used 1:1 with cell suspensions to measure viable cells. Hazard-may cause cancer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">G418 Sulphate (Geneticin)</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-gn-5</td>
			<td>Agent for selecting transfected eukaryotic cells. Hazard-may cause allergy or asthma symptoms or breathing difficluties.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3H-Thymidine</td>
			<td style="width:183px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:181px;">NET-027</td>
			<td>This radioactive nucleoside is incorporated into chromosomal DNA during mitosis. Hazard-radiation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vialight Plus Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>LT07-221</td>
			<td>Bioluminescent detection of cellular ATP to quantify viability, using ATP Monitoring Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Prestoblue Cell Viability Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A13261</td>
			<td>Resazurin-based indicator of cell viability. Turns red in color in the reducing environment of the cell</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Nunc Minitray with Nunclon Delta Surface (72 well)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>136528</td>
			<td>Small microtitre plate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">96 well Tissue Culture Plate</td>
			<td style="width:183px;">Falcon, Corning Inc.</td>
			<td style="width:181px;">353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">DMEM (1X)</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:181px;">11965-92</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">GlutaMAX (100X)</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:181px;">35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">Foetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:181px;">&#160;10099-141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell Harvester</td>
			<td style="width:183px;">Tomtec Life Sciences</td>
			<td style="width:181px;">N/A</td>
			<td>Tomtec Harvester, 96 Mach 3M Cell Harvester</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Liquid Scintillation Counter</td>
			<td style="width:183px;">LKB Wallac</td>
			<td style="width:181px;">1205</td>
			<td>LKB Wallac 1205 Betaplate Scintillation Counter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">UniFilter-96 GF/B</td>
			<td style="width:183px;">Perkin Elmer</td>
			<td>6005177</td>
			<td>White 96-well Barex Microplate with GF/B filterof 1 &#181;m poresize</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:183px;">Gibco, Life Technologies</td>
			<td style="width:181px;">15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:183px;">Gibco, Life Technologies</td>
			<td style="width:181px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:323px;">0.22um pore cellulose acetate centrifuge tube filter unit</td>
			<td style="width:183px;">Costar, Corning Inc.</td>
			<td style="width:181px;">8160</td>
			<td>Centrifuge tube filters have a 0.22&#181;m pore CA membrane-containing filter unit within a 500&#181;l capacity polypropylene microcentrifuge tube.</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Fluorescence Reader</td>
			<td style="width:183px;">BioTek</td>
			<td style="width:181px;">N/A</td>
			<td>BioTek Synergy 4 Hybrid Microplate Reader&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple bioassay for the evaluation of vascular endothelial growth factors

تحليل تحركات مستقبلات التيروزين وبروابط التفاعل على المشاركة في البيولوجيا الأوعية الدموية غالبا ما يكون صعبا بسبب التعبير التأسيسي للعائلات مستقبلات ذات الصلة، مجموعة واسعة من بروابط ذات الصلة، وصعوبة التعامل مع الثقافات الأولية من الخلايا البطانية المتخصصة. نحن هنا وصف الأحيائي للكشف عن بروابط إلى عامل النمو البطاني الوعائي مستقبلات-2 (VEGFR-2)، محول رئيسي للإشارات التي تعزز الأوعية الدموية وlymphangiogenesis. وأعرب كدنا] ترميز الانصهار في المنطقة خارج الخلية (ملزم يجند) من VEGFR-2 مع الغشاء والمناطق هيولي من مستقبلات الإريثروبويتين (EpoR) في خط الخلية التي تعتمد على عامل با / F3. ينمو هذا الخط خلية في وجود انترلوكين 3 (IL-3) والانسحاب من هذا العامل النتائج في موت الخلايا خلال 24 ساعة. التعبير عن / EpoR مستقبلات الانصهار VEGFR-2 يوفر آلية بديلة لتعزيز بقاء وامكاناتهاLLY انتشار الخلايا با / F3 ستابلي في وجود يجند قادرة على ربط وعبر ربط جزء خارج الخلية من البروتين الانصهار (أي واحد يمكن أن عبور الارتباط المنطقة خارج الخلية VEGFR-2). الفحص لا يمكن أن يؤديها بطريقتين: نهج شبه الكمية التي كميات صغيرة من يجند وخلايا تسمح نتيجة سريعة في 24 ساعة، والنهج الكمي التي تنطوي على علامات بديلة من عدد الخلايا قابلة للحياة. فحص من السهل نسبيا على القيام بها، هو استجابة للغاية أن تعرف VEGFR-2 بروابط ويمكن أن تستوعب مثبطات خارج الخلية من VEGFR-2 الإشارات مثل الأجسام المضادة وحيدة النسيلة لمستقبلات أو بروابط، والفخاخ يجند القابلة للذوبان.

في هذا القسم، وتبين لنا نتائج التجربة يدل على السمات الأساسية لالأحيائي VEGFR-2-EpoR با / F3 (انظر الشكل رقم 1 لمبادئ الفحص). وتبين الدراسات التي نشرت غيرها من التطبيقات الأوسع للفحص عن بديلة VEGFR-2 بروابط، جزيئات VEGF متحولة والاجسام المضادة المثبطة <s...

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors at JoVE.com

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

نحن تصف الأحيائي القائم على خلية بسيط للكشف، قياس ورصد النشاط من أعضاء البطانية الأسرة عامل نمو الأوعية الدموية بروابط. يستخدم فحص مستقبلات خيالية أعرب في خط الخلية التي تعتمد على عامل أن يقدم تقييما شبه كمي أو الكمي للمستقبلات ملزمة وعبر ربط بواسطة يجند.

والأحيائي بسيط لتقييم العوامل الأوعية الدموية غشائي النمو

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive ...

a-simple-bioassay-for-evaluation-vascular-endothelial-growth

Research

JoVE Journal

Biology

9.6K Views.  Peter MacCallum Cancer Centre.  نحن تصف الأحيائي القائم على خلية بسيط للكشف، قياس ورصد النشاط من أعضاء البطانية الأسرة عامل نمو الأوعية الدموية بروابط. يستخدم فحص مستقبلات خيالية أعرب في خط الخلية التي تعتمد على عامل أن يقدم تقييما شبه كمي أو الكمي للمستقبلات ملزمة وعبر ...

Video: A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

A Simple Protocol for Extracting Hemocytes from Wild Caterpillars

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle 1. In larval stages of insects belonging to the orders of Lepidoptera (moths and butterflies) and Diptera (true flies), hemocytes are formed from the lymph gland (a specialized hematopoietic organ) or embryonic cells and can be carried through to the adult stage. Embryonic hemocytes are involved in cell migration during development and chemotaxis regulation during inflammation. They also take part in cell apoptosis and are essential for embryogenesis 2. Hemocytes mediate the cellular arm of the insect innate immune response that includes several functions, such as cell spreading, cell aggregation, formation of nodules, phagocytosis and encapsulation of foreign invaders 3. They are also responsible for orchestrating specific insect humoral defenses during infection, such as the production of antimicrobial peptides and other effector molecules 4, 5. Hemocyte morphology and function have mainly been studied in genetic or physiological insect models, including the fruit fly, Drosophila melanogaster 6, 7, the mosquitoes Aedes aegypti and Anopheles gambiae 8, 9 and the tobacco hornworm, Manduca sexta 10, 11. However, little information currently exists about the diversity, classification, morphology and function of hemocytes in non-model insect species, especially those collected from the wild 12.
Here we describe a simple and efficient protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars. We use penultimate instar Lithacodes fasciola (yellow-shouldered slug moth) (Figure 1) and Euclea delphinii (spiny oak slug) caterpillars (Lepidoptera: Limacodidae) and show that sufficient volumes of hemolymph (insect blood) can be isolated and hemocyte numbers counted from individual larvae. This method can be used to efficiently study hemocyte types in these species as well as in other related lepidopteran caterpillars harvested from the field, or it can be readily combined with immunological assays designed to investigate hemocyte function following infection with microbial or parasitic organisms 13.

Insect hemocytes carry out many important functions, both immune and non-immune, throughout all stages of insect development. Our present knowledge of hemocyte types and function comes from studies on insect genetic models. Here, we present a method for extracting, quantifying and visualizing hemocytes from wild caterpillars.

A بروتوكول بسيط لاستخراج اليرقات من Hemocytes البرية

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle ...

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline cells. This heterogeneity is an important drawback concerning the study of the bases of mammalian spermatogenesis, as pure or enriched cell populations in certain stages of sperm development are needed for most molecular analyses1.
 Various strategies such as Staput2,3, centrifugal elutriation1, and flow cytometry (FC)4,5 have been employed to obtain enriched or purified testicular cell populations in order to enable differential gene expression studies. 
It is required that cells are in suspension for most enrichment/ purification approaches. Ideally, the cell suspension will be representative of the original tissue, have a high proportion of viable cells and few multinucleates - which tend to form because of the syncytial nature of the seminiferous epithelium6,7 - and lack cell clumps1 . Previous reports had evidenced that testicular cell suspensions prepared by an exclusively mechanical method clumped more easily than trypsinized ones1 . On the other hand, enzymatic treatments with RNAses and/or disaggregating enzymes like trypsin and collagenase lead to specific macromolecules degradation, which is undesirable for certain downstream applications. The ideal process should be as short as possible and involve minimal manipulation, so as to achieve a good preservation of macromolecules of interest such as mRNAs. Current protocols for the preparation of cell suspensions from solid tissues are usually time-consuming, highly operator-dependent, and may selectively damage certain cell types1,8 . 
	The protocol presented here combines the advantages of a highly reproducible and extremely brief mechanical disaggregation with the absence of enzymatic treatment, leading to good quality cell suspensions that can be used for flow cytometric analysis and sorting4, and ulterior gene expression studies9 .

A novel protocol for the mechanical preparation of testicular cell suspensions from rodent material, avoiding enzymes and detergents, is described. The method is very simple, fast, reproducible, and renders good quality cell suspensions, which are suitable for flow sorting and RNA extraction.

تقنيات بسيطة وفعالة لإعداد تعليق خلية الخصية

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

عزل خلايا الفئران صمام غشائي

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

العزلة والثقافة الابتدائية من خلايا الفأر الأورطي غشائي

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

عزل الفئران التاجي الأوعية الدموية خلايا العضلات الملساء

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

عزل الترشيح من الأحماض النووية: وبسيطة وسريعة استخراج الحمض النووي الطريقة

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-&#946; Signaling

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with organ fibrosis. In these conditions, differentiated endothelial cells acquire mesenchymal-like phenotypes. This process is called endothelial-mesenchymal transition (EndMT) and is characterized by downregulation of endothelial markers, upregulation of mesenchymal markers, and morphological changes. EndMT is induced by several signaling pathways, including transforming growth factor (TGF)-&#946;, Wnt, and Notch, and regulated by molecular mechanisms similar to those of epithelial-mesenchymal transition (EMT) important for gastrulation, tissue fibrosis, and cancer metastasis. Understanding the mechanisms of EndMT is important to develop diagnostic and therapeutic approaches targeting EndMT. Robust induction of EndMT in vitro is useful to characterize common gene expression signatures, identify druggable molecular mechanisms, and screen for modulators of EndMT. Here, we describe an in vitro method for induction of EndMT. MS-1 mouse pancreatic microvascular endothelial cells undergo EndMT after prolonged exposure to TGF-&#946; and show upregulation of mesenchymal markers and morphological changes as well as induction of multiple inflammatory chemokines and cytokines. Methods for the analysis of microRNA (miRNA) modulation are also included. These methods provide a platform to investigate mechanisms underlying EndMT and the contribution of miRNAs to EndMT.

A protocol for in vitro induction of endothelial-mesenchymal transition (EndMT), which is useful for investigating cellular signaling pathways involved in EndMT, is described. In this experimental model, EndMT is induced by treatment with TGF-&#946; in MS-1 endothelial cells.

التحليل الجزيئي غشائي الوسيطة الانتقالية الناجمة عن تحويل الإشارات عامل النمو-β

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with ...

Using En Face Immunofluorescence Staining to Observe Vascular Endothelial Cells Directly

Aberrant changes in endothelial phenotype and morphology are considered to be initial events in the pathogenesis of atherosclerosis. Direct observation of the intact endothelium will provide valuable information for understanding the cellular and molecular events in the dysfunctional endothelial cells. Here, we describe a modified en face immunofluorescence staining technique which enables scientists to obtain clear images of the intact endothelial surface and analyze the molecule expression patterns in situ. The method is simple and reliable for observing the entire endothelial monolayer at different sites of the aorta. This technique may be a promising tool for understanding the pathophysiology of atherosclerosis, especially at an early stage.

Here, we present a protocol for immunofluorescence staining to observe the endothelial cells of the mouse aorta directly. This technique is useful when studying the cellular and molecular phenotype of endothelial cells in different flow patterns and in the development of atherosclerosis.

استخدام تلطيخ الفلورة المناعية للوجه لمراقبة الخلايا البطانية الوعائية مباشرة

Aberrant changes in endothelial phenotype and morphology are considered to be initial events in the pathogenesis of atherosclerosis. Direct observation of ...

Demonstrating a Linear Relationship Between Vascular Endothelial Growth Factor and Luteinizing Hormone in Kidney Cortex Extracts

Vascular endothelial growth factor (VEGF) helps to control angiogenesis and vascular permeability in the kidney. Renal disorders, such as diabetic nephropathy, are associated with VEGF dysregulation in the kidney. The factors that govern VEGF under physiologic conditions in the kidney are not well-understood. Luteinizing hormone (LH), a pro-angiogenic hormone, helps regulate physiologic VEGF expression in reproductive organs. Given that LH receptors are found in the kidney, we, at Zietchick Research Institute, hypothesized here that LH also helps regulate VEGF expression in the kidney as well. To provide evidence, we aimed to show that LH levels are able to predict VEGF levels in the mammalian kidney. Most VEGF-related investigations involving the kidney have used lower order mammals as models (i.e., rodents and rabbits). To translate this work to the human body, it was decided to examine the relationship between VEGF and LH in higher order mammals (i.e., bovine and porcine models). This protocol uses the total protein lysate from the kidney cortex. Keys to this method&#39;s success include procurement of kidneys from slaughterhouse animals immediately after death as well as normalization of analyte levels (in the kidney extract) by total protein. This study successfully demonstrates a significant linear relationship between LH and VEGF in both bovine and porcine kidneys. The results are reproducible in two different species. The study provides supporting evidence that the use of kidney extracts from cows and pigs are an excellent, economical, and abundant resource for the study of renal physiology, particularly for examining the correlation between VEGF and other analytes.

Presented here is a protocol for utilizing a cortical kidney extract preparation and total protein normalization to demonstrate the correlation between vascular endothelial growth factor and luteinizing hormone in the mammalian kidney.

إظهار العلاقة الخطية بين عامل النمو الغشائي الوعائي والهرمون الملوتيني في مقتطفات القشرة الكلوية

Vascular endothelial growth factor (VEGF) helps to control angiogenesis and vascular permeability in the kidney. Renal disorders, such as diabetic ...

Isolation of Human Primary Valve Cells for In vitro Disease Modeling

Calcific aortic valve disease (CAVD) is present in nearly a third of the elderly population. Thickening, stiffening, and calcification of the aortic valve causes aortic stenosis and contributes to heart failure and stroke. Disease pathogenesis is multifactorial, and stresses such as inflammation, extracellular matrix remodeling, turbulent flow, and mechanical stress and strain contribute to the osteogenic differentiation of valve endothelial and valve interstitial cells. However, the precise initiating factors that drive the osteogenic transition of a healthy cell into a calcifying cell are not fully defined. Further, the only current therapy for CAVD-induced aortic stenosis is aortic valve replacement, whereby the native valve is removed (surgical aortic valve replacement, SAVR) or a fully collapsible replacement valve is inserted via a catheter (transcatheter aortic valve replacement, TAVR). These surgical procedures come at a high cost and with serious risks; thus, identifying novel therapeutic targets for drug discovery is imperative. To that end, the present study develops a workflow where surgically removed tissues from patients and donor cadaver tissues are used to create patient-specific primary lines of valvular cells for in vitro disease modeling. This protocol introduces the utilization of a cold storage solution, commonly utilized in organ transplant, to reduce the damage caused by the often-lengthy procurement time between tissue excision and laboratory processing with the benefit of greatly stabilizing cells of the excised tissue. The results of the present study demonstrate that isolated valve cells retain their proliferative capacity and endothelial and interstitial phenotypes in culture upwards of several days after valve removal from the donor. Using these materials allows for the collection of control and CAVD cells, from which both control and disease cell lines are established.

This protocol describes the collection of human aortic valves extracted during surgical aortic valve replacement procedures or from cadaveric tissue, and the subsequent isolation, expansion, and characterization of patient specific primary valve endothelial and interstitial cells. Included are important details regarding the processes needed to ensure cell viability and phenotype specificity.

عزل خلايا الصمام الأولي البشري لنمذجة الأمراض في المختبر

Calcific aortic valve disease (CAVD) is present in nearly a third of the elderly population. Thickening, stiffening, and calcification of the aortic valve ...