يعد تكوين مادة تخثر الصفائح الدموية أمرا بالغ الأهمية للحفاظ على الإرقاء. تتضمن هذه العملية التعبير عن الدهون الفوسفورية وإطلاق الحويصلات الدقيقة على سطح الصفائح الدموية ، وهو أمر ضروري لخطوات التخثر. قدمت تقييمات هذه العملية بيانات جديدة حول كيفية استجابات التخثر للصفائح الدموية في الأمراض البشرية المتنوعة.
كان قياس التدفق الخلوي حجر الزاوية واكتسب قبولا واسع النطاق في تقييم تعبير الفوسفاتيديل سيرين على الصفائح الدموية وإطلاق الحويصلات الدقيقة. يستغرق عزل الصفائح الدموية المنقاة وتحليلها من الدم وقتا طويلا ويتطلب معدات مختبرية متخصصة ، وبالتالي فهي غير متاحة حاليا للتشخيص السريري الروتيني. يعد تحليل التعرض للفوسفاتيديل سيرين وإطلاق الحويصلات الدقيقة أمرا صعبا أيضا نظرا لصغر حجمها وقلة عدد الأحداث الإيجابية لعلامات الاهتمام.
للبدء ، اجمع الدم الوريدي المحيطي في أنابيب تجميع تحتوي على سترات ثلاثي الصوديوم المضادة للتخثر النشطة مع حامض الستريك وسكر العنب. اقلب الأنبوب برفق لخلط الدم مع مضاد التخثر واترك الخليط يرتاح في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. عد الصفائح الدموية باستخدام عداد خلوي آلي لتحديد السرعة الصحيحة للطرد المركزي.
لتحضير البلازما الغنية بالصفائح الدموية ، قم بالطرد المركزي للدم عند 250 جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة دون تطبيق الكسر. ثم أضف 1 مليلتر من ACDA و 6.25 ميكرولتر من الأبيراز إلى 9 ملليلتر من البلازما الغنية بالصفائح الدموية. الطرد المركزي الخليط على حرارة 1 ، 100 جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
باستخدام ماصة المراعي ، قم بإزالة المادة الطافية التي تحتوي على البلازما الفقيرة للصفائح الدموية وأعد تعليق حبيبات الصفائح الدموية برفق في 1 مليلتر من محلول الغسيل. ثم أضف 3 إلى 4 ملليلتر من عازلة الغسيل إلى الأنبوب وقم بطرده مرة أخرى. بعد إزالة المادة الطافية ، أعد تعليق الحبيبات في 1 مليلتر من محلول الغسيل.
انقل 150 ميكرولترا من تعليق الصفائح الدموية إلى أنبوب سعة 1.5 مليلتر لعد الخلايا في عداد الخلايا الآلي. أضف 3 إلى 4 ملليلتر من مخزن الغسيل المؤقت إلى التعليق المتبقي لإجراء غسيل إضافي كما هو موضح سابقا. بعد ذلك ، أعد تعليق حبيبات الصفائح الدموية في المخزن المؤقت للتفاعل لتحقيق تركيز نهائي 5 × 10 إلى قوة 11 صفيحة زجاجية لكل لتر.
للبدء ، احصل على الصفائح الدموية المغسولة في المخزن المؤقت المطلوب لقياس التدفق الخلوي. تحضير جميع ناهضات وفلوروكرومات في المخزن المؤقت للتفاعل. بالنسبة للمقايسات الداخلية ، أضف 100 ميكرولتر من الصفائح الدموية المغسولة بتركيز 50 × 10 إلى قوة 9 صفائح ضفائح لكل لتر إلى أنابيب معالجة مختلفة.
رج كل قطعة برفق واحتضانها على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. ثم أضف 5 ميكرولتر من Annexin V-FITC غير المخفف إلى كل أنبوب دقيق واحتضانه. بعد ذلك ، أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتفاعل إلى كل أنبوب لإيقاف العملية.
قم ببوابة مجموعة الصفائح الدموية باستخدام التشتت الأمامي أو FSC واستخدم مخططات الكثافة لتحديد كل مجموعة سكانية بشكل مستقل. اضبط الحد الأقصى السالب في أقصى يمين مجموعة الصفائح الدموية في حالة الراحة. بعد التنشيط ، صنف الأحداث الموجودة على يمين هذا القطع على أنها صفائح دموية تعرض الفوسفاتيديل سيرين.
للتمييز بين الحويصلات الدقيقة ، اضبط القطع على أدنى قيمة FSC لوحظت في مجموعة الصفائح الدموية المريحة. بعد التنشيط ، قم بتصنيف الأحداث الإيجابية فوسفاتيديل سيرين تحت هذه العتبة على أنها ميكروويسيلات. أشارت قياسات خط الأساس إلى أن أقل من 2.9٪ من الصفائح الدموية غير المنشطة أظهرت التعرض للفوسفاتيديل سيرين.
عند التنشيط ، أصبح 26.7٪ من الصفائح الدموية إيجابيا للفوسفاتيديل سيرين مع الكولاجين ، و 9.1٪ مع الثرومبين ، و 36.2٪ مع كل من الكولاجين والثرومبين. نتج عن المعالجة الأيونوفورية 49.6٪ من الصفائح الدموية الإيجابية للفوسفاتيديل سيرين. كانت نسبة خط الأساس للحويصلات الدقيقة 0.3٪ لوحظت زيادات كبيرة فقط مع الكولاجين والثرومبين معا عند حوالي 11.4٪ وأكثر من ذلك مع الأيونوفورات بنسبة 44٪
