يسمح لنا هذا البروتوكول بالإجابة على مجموعة متنوعة من الأسئلة حول الطريقة التي يعمل بها القص على الخلايا في الحل ويوفر تحكمًا كبيرًا في مدة القص وحجمه. على عكس التقنيات الأخرى، التي تكشف عن تأثير القص على الخلايا التي يتم شل حركتها، هذه التقنية تسمح لنا بتطبيق القص على الخلايا في الحل وتفسح المجال أمام مجموعة من أساليب الكشف عن إشارة المصب. بعد الحصول على الدم المحيطي من متبرع بالغ موافقة وصحية في أنبوب 4.5 ملليلتر من سيترات ثلاثي الصوديوم 3.8٪، الطرد المركزي الدم للحصول على البلازما الغنية بالصفائح الدموية، واستخدام تلميح ماصة قطع في زاوية 45 درجة لإزالة بعناية أعلى، غائم، طبقة البلازما الصفراء الغنية بالصفائح الدموية.
الحصول على عدد الصفائح الدموية عن طريق تعداد الدم الكامل، وضبط عدد الصفائح الدموية إلى ما يقرب من 2.5 مرات 10 إلى الصفائح الدموية الخامسة لكل ميكرولتر مع البلازما الصفائح الدموية البشرية تجمع الفقراء. ثم، ضع التعليق عند درجة حرارة 22 درجة مئوية مع دوران لطيف. لعلاج ligand، ببطء إضافة الأجسام المضادة أو ليغاند من الفائدة إلى البلازما الغنية بالصفائح الدموية، وخلط الصفائح الدموية بلطف.
أثناء الحضانة، بدوره على الزكات لوحة مخروط، وتعيين درجة حرارة لوحة إلى 22 درجة مئوية. بعد خمس إلى 10 دقائق، نقل البلازما المعالجة الغنية بالصفائح الدموية إلى درجة الحرارة التي تسيطر عليها مخروط لوحة فيسكوميتر مباشرة في وسط لوحة، مع الحرص على أن يتم إيداع كل من العينة بين المخروط ولوحة عند نقطة الاتصال. لتطبيق القص على العينة، حساب القص وفقا لدليل المقاييس، وتطبيق القص على العينة بمعدل المناسبة والمدة.
في نهاية التطبيق، ورفع المخروط حوالي مليمترين قبالة لوحة، بحيث العينة لا تزال على اتصال مع كل من لوحة ومخروط، واستخدام تلميح ماصة هلام تحميل لجمع خمسة إلى 10 ميكرولترات من مركز حجم العينة. ثم احتضان العينة القص مع الأجسام المضادة ضد علامات السطح من الفائدة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وإصلاح العينات في 2٪ شبهformaldehyde لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. لتحليل العينات حسب قياس التدفق، قم بجمع 20,000 حدث على الأقل لكل حالة، وتحديد قوة الإشارة لكل علامة فلورية، باستخدام قيمة الارتفاع لشدة كل فلوري.
ثم استخدام التحكم السلبي مع الألبومين المصل البقري أو السيارة لرسم بوابة، باستثناء الأحداث الفلورية الخلفية السلبية، وتحديد النسبة المئوية للأحداث داخل البوابة لجميع الظروف التجريبية. تعبير علامة تنشيط الصفائح الدموية ردا على تطبيق قوة القص غير منظم بطريقة تعتمد على الوقت. هنا، تظهر قراءات تمثيلية لتنشيط الصفائح الدموية البشرية في وجود جسمين مضادين يستهدفان المجال N-terminal من glycoprotein 1b-IX والأجسام المضادة للتحكم واحد تحت ظروف مُجَرَّة وثابتة.
وقد زاد التعبير عن جميع علامات التنشيط الثلاث بشكل كبير في وجود قوات القص واستهداف الأجسام المضادة ، مقارنة إما بالظروف الثابتة أو في وجود أجسام مضادة للمراقبة. وتجدر الإشارة إلى أن العلاج بالأجسام المضادة بقوة غير ملزمة منخفضة جدًا بحيث لا يمكن تشغيل تنشيط glycoprotein 1b-IX لا يؤدي إلى رفع تنظيم علامة تنشيط الصفائح الدموية في ظل ظروف قوة ثابتة أو القص. علاوة على ذلك، البلازما من مرضى الجلطات المناعية التي تحتوي على أجسام مضادة ضد جليكوبروتين 1b-IX الردود تعتمد القص الزناد على النقيض من البلازما من المرضى دون جليكوبروتين 1b-IX الأجسام المضادة المستهدفة.
بالإضافة إلى التحليلات الانسيابية، يمكن أيضاً أن تكون الخلايا التي تعرضت للمقطّع مُنْحَةً لللطخة الغربية، و ELISA، وتحليل المواصفات الكتلي لتحديد أيّ تغيّرات في مستوى البروتين. كما هو الحال دائما، عند استخدام عينات الدم أو الإنسان، تأكد من ارتداء معدات الحماية المناسبة واتباع سلامة المختبر والمبادئ التوجيهية لمسببات الأمراض المولودة في الدم من مؤسستك.
