A formação de pró-coagulante plaquetário é crucial para manter a hemostasia. Esse processo envolve a expressão de fosfolipídios e a liberação de microvesículas na superfície plaquetária, o que é essencial para as etapas de coagulação. As avaliações desse processo forneceram novos dados sobre como as respostas pró-coagulantes plaquetárias são em diversas doenças humanas.
A citometria de fluxo tem sido uma pedra angular e ganhou ampla aceitação na avaliação da expressão de fosfatidilserina nas plaquetas e na liberação de microvesículas. O isolamento e a análise de plaquetas purificadas do sangue são demorados e requerem equipamentos laboratoriais especializados e, portanto, não estão atualmente disponíveis para diagnóstico clínico de rotina. A análise da exposição à fosfatidilserina e da liberação de microvesículas também é desafiadora devido ao seu pequeno tamanho e ao baixo número de eventos positivos para marcadores de interesse.
Para começar, colete sangue venoso periférico em tubos de coleta contendo o anticoagulante ativo citrato trissódico com ácido cítrico e dextrose. Inverta suavemente o tubo para misturar o sangue com o anticoagulante e deixe a mistura descansar em temperatura ambiente por 15 minutos. Conte as plaquetas usando um contador de células automatizado para determinar a velocidade correta para centrifugação.
Para preparar o plasma rico em plaquetas, centrifugue o sangue a 250 g por 10 minutos em temperatura ambiente sem aplicar a quebra. Em seguida, adicione 1 mililitro de ACDA e 6,25 microlitros de apirase a 9 mililitros do plasma rico em plaquetas. Centrifugue a mistura a 1,100 g durante 10 minutos à temperatura ambiente.
Usando uma pipeta de pastagem, remova o sobrenadante contendo plasma pobre em plaquetas e ressuspenda o pellet de plaquetas suavemente em 1 mililitro de tampão de lavagem. Em seguida, adicione 3 a 4 mililitros de tampão de lavagem ao tubo e centrifugue-o novamente. Depois de remover o sobrenadante, ressuspenda o pellet em 1 mililitro de tampão de lavagem.
Transfira 150 microlitros da suspensão de plaquetas para um tubo de 1,5 mililitro para contagem das células em um contador de células automatizado. Adicione 3 a 4 mililitros de tampão de lavagem à suspensão restante para realizar uma lavagem adicional, conforme demonstrado anteriormente. Em seguida, ressuspenda o grânulo de plaquetas no tampão de reação para atingir uma concentração final de 5 x 10 elevado a 11 plaquetas por litro.
Para começar, obtenha plaquetas lavadas no tampão desejado para citometria de fluxo. Prepare todos os agonistas e fluorocromos no tampão de reação. Para ensaios internos, adicione 100 microlitros de plaquetas lavadas na concentração de 50 x 10 à potência de 9 plaquetas por litro em diferentes tubos de tratamento.
Agite suavemente cada alíquota e incube a 37 graus Celsius por 5 minutos. Em seguida, adicione 5 microlitros de Anexina V-FITC não diluída a cada microtubo e incuba. Depois, adicione 500 microlitros de tampão de reação a cada tubo para interromper o processo.
Bloqueie a população de plaquetas usando dispersão direta ou FSC e use gráficos de densidade para identificar cada população de forma independente. Defina o ponto de corte negativo na extremidade direita da população de plaquetas do estado em repouso. Após a ativação, classifique os eventos à direita desse ponto de corte como plaquetas expondo fosfatidilserina.
Para diferenciar microvesículas, defina o ponto de corte no menor valor de FSC observado na população de plaquetas em repouso. Após a ativação, classifique os eventos positivos de fosfatidilserina abaixo desse limite como microvesículas. As medições basais indicaram que menos de 2,9% das plaquetas não ativadas exibiram exposição à fosfatidilserina.
Após a ativação, 26,7% das plaquetas tornaram-se fosfatidilserina positiva com colágeno, 9,1% com trombina e 36,2% com colágeno e trombina. O tratamento com ionóforo resultou em plaquetas positivas para 49,6% de fosfatidilserina. A proporção basal de microvesículas foi de 0,3%Aumentos significativos foram observados apenas com colágeno e trombina juntos em cerca de 11,4%e mais ainda com ionóforos em 44%
