يسمح هذا البروتوكول للباحثين ببناء عدد من نماذج أسماك الزرد غير المتوفرة سابقا لمتغيرات النوكليوتيدات المفردة ذات الصلة بالمرض. تعد قيود PAM عقبة رئيسية أمام إنشاء نماذج حيوانية دقيقة ، ويتيح zSpRY-ABE8e التحويل الفعال للأدينين إلى قاعدة الجوانين مع انخفاض التداخل وتقييد PAN المريح. يمكن استخدام هذه الأداة لبناء نماذج دقيقة من أسماك الزرد لدراسة آليات مرض الخصائص المسببة للأمراض المتعلقة بمشاة البحرية أحادية النوكليوتيدات ، وكذلك فحص الأدوية لهذا المرض.
للبدء ، قم بإعداد نظام مجتذب الماصة الدقيقة وقم بالتسخين المسبق لمدة 30 دقيقة على الأقل. لسحب الشعيرات الدموية الزجاجية ، حدد برنامجا ، واضبط قيمة اختبار المنحدر على أنها حرارة ، و 50 كسحب ، والسرعة عند 100 ، والوقت على 50 ، والضغط على 30. بعد ذلك ، قم بتثبيت الأنبوب الشعري للتأكد من وجوده في الأخدود.
اضغط على سحب بدء / إيقاف "لتشغيل البرنامج. للحفاظ على الشعيرات الدموية المسحوبة ، أدخلها في رغوة تحتوي على فجوات مع إبقاء الإبرة معلقة. للتجريب ، استخدم zSpRY-ABE8e mRNA الموصوف في المخطوطة ، وسهل التحرير sgRNA المعدل بفوسفوروثيوات 2'O-methyl في كلا الطرفين.
بالنسبة لتصميم gRNA ، حدد NRN بشكل تفضيلي كتسلسل PAM ، حيث يظهر zSpRY-ABE8e تفضيلا أعلى ل NRN PAM من NYN PAM. أدخل نيوكليوتيد الأدينين المستهدف في نافذة التحرير النشطة للغاية من النوكليوتيدات الثالثة إلى التاسعة على طول الفاصل الأولي. قم بإعداد خزانات تربية في الليلة السابقة للحقن.
أدخل مقسما ، وضع اثنين من إناث وذكور الزرد في كل حوض. ضع غطاء على كل خزان. في صباح اليوم التالي ، باستخدام أطراف وأنابيب وقفازات خالية من RNase ، امزج mRNA المذاب و EEgRNA على الجليد إلى تركيز نهائي قدره 400 و 200 نانوجرام لكل ميكرولتر ، على التوالي.
لتكوين الحاقن الدقيق الهوائي ، أولا ، أغلق صمام الضغط الجزئي لمضخة الهواء. بعد ذلك ، افتح الصمام الرئيسي ، وفك أسطوانة الغاز ، واضبط ضغط صمام الضغط الجزئي على 0.2 ميجاباسكال. الآن ، قم بتشغيل الحاقن الدقيق واضبط الوضع على المؤقت.
اضبط صمام ضغط المعلمة على 20 رطلا لكل بوصة مربعة وقيمة المؤقت على 0.040 ثانية. باستخدام ملقط دقيق ، قم بكسر إبر الشعيرات الدموية الزجاجية المسحوبة تحت مجهر ستيريو. باستخدام طرف ماصة microloader ، أضف خليط mRNA / gRNA إلى طرف الشعيرات الدموية الزجاجية وقم بتوصيل الإبرة بالمعالج الدقيق.
قم بتكوين قيمة الضغط والمؤقت لإنتاج خليط نانولتر لكل حقنة باستخدام غطاء دقيق. بعد تربية الأسماك لمدة 10 إلى 15 دقيقة ، اجمع البيض في مصفاة. فحص مرحلة الخلية وجودة البيض تحت المجهر ستيريو.
حدد بويضات وحيدة الخلية للحقن لتحسين كفاءة التحرير. قم بتبطين البيض على صفيحة حقن الأغاروز بنسبة 1.5٪ وحقن نانولتر من خليط الحمض النووي الريبي في خلية الأجنة باستخدام المجهر. جمع البيض في أطباق بتري مع E3 Buffer واحتضانها في 28 درجة مئوية.
قم بإزالة البيض الميت وقم بتغيير مخزن الاستزراع كل 12 ساعة لمدة 48 ساعة بعد الإخصاب. بعد 48 ساعة بعد الإخصاب ، اجمع ثلاث مجموعات من ستة أجنة محقونة تم اختيارها عشوائيا في أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل. بمجرد جمع ستة أجنة تحكم تم اختيارها عشوائيا ، استخدم ماصة لاستنشاق المخزن المؤقت E3 المتبقي.
أضف 40 ميكرولترا من 50 ملليمولار هيدروكسيد الصوديوم إلى الأجنة. ضع الأنابيب في حمام معدني عند 95 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة ، ثم دوامة لمدة 15 ثانية. أضف أربعة ميكرولترات من مولار واحد تريس هيدروكلوريد عند الأس الهيدروجيني ثمانية في كل أنبوب.
أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 2000g لمدة 10 ثوان في درجة حرارة الغرفة. نقل المادة الطافية إلى أنبوب PCR جديد. قم بإزالة ميكرولتر واحد من المادة الطافية من أنبوب PCR واستخدمه لتسلسل سانجر.
ثم قم بتخزين المادة الطافية المتبقية عند 20 درجة مئوية. لتحليل بيانات تسلسل سانجر ، ابدأ بتحميل ملف التسلسل في مربع تحميل ملف ab1. أدخل تسلسل gRNA للزوج الأساسي 20 في الاتجاه من 5'إلى 3'في مربع تسلسل إدخال gRNA.
أدخل الموضع الأساسي المقابل في مربعي 5'start و 3'end. احصل على كفاءة التحرير الأساسية من خلال النقر على التحرير التنبئي "والتحقق من جودة بيانات التسلسل. تم بناء نموذج لفقر الدم الأسود الماسي عن طريق تحويل الأدينين من كودون البداية من Tsr2 إلى الجوانين.
أظهر تحليل EditR لبيانات التسلسل تداخلا AG في قاعدة الأدينين لكودون بدء Tsr2. أظهر النمط الظاهري لأجنة Tsr2 البالغة من العمر يومين عيونا أصغر مقارنة بالأجنة الضابطة. كما لوحظ تورم التامور في الأجنة الطافرة.
من أجل تحقيق تحرير أساسي فعال ، يرجى اتباع مبدأ التصميم التوجيهي المذكور سابقا بدقة ، وهو شرط أساسي لنجاح التجربة. النماذج الدقيقة ضرورية لدراسة الأمراض المرتبطة بمتغير النوكليوتيدات المفردة. يوفر تطوير SprY-ABE8e أداة فعالة للنمذجة الدقيقة ، مما يساعد على تعزيز البحث في آليات المرض والعلاجات.
