توفر الكهف نظامًا مقنعًا للتحقيق في الصفات المورفولوجية والتنموية والسلوكية المتنوعة. ولكن أحد العوامل المقيدة في إنشاء هذا النظام النموذجي هو نقص الأدوات الوراثية التي من شأنها أن تسمح لنا بالتلاعب بوظيفة الجينات. هنا نبرهن على ثلاثة نهج مختلفة للتلاعب في وظيفة الجينات في أسماك الكهوف المكسيكية، Astyanax mexicanus.
وستمكن هذه الأدوات من دراسة الجينات الكامنة في الاختلافات الطبيعية بين الأسماك السطحية وسمك الكهوف وكيفية ارتباطها بالنمط الظاهري. بيثاني ستال، موهوبة في مختبري ستوضح هذا الإجراء. قبل البدء في الإجراء، وملء طبق بيتري 100 ملليلتر مع دافئ 3٪ agarose حل في مياه نظام الأسماك ووضع بعناية قالب حقن البيض في agarose في زاوية 45 درجة، قبل خفض ببطء القالب في agarose لتجنب محاصرة الهواء تحت القالب.
عندما تتوطد agarose، قم بإزالة القالب بعناية ثم تخزين اللوحة عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد. ثم سحب الإبر من البورسليكات الشعرية الزجاجية وسحب إبرة القطب وفقا للمبادئ التوجيهية للشركة المصنعة. في يوم الحقن، استخدم ماصة زجاجية لنقل بيض خلية واحدة إلى لوحة الحقن، وملء ما يصل إلى خمسة صفوف من لوحة الحقن مع 30 إلى 40 بيضة في الصف الواحد.
الحفاظ على البيض رطب مع كمية صغيرة من المياه نظام الأسماك. ذوبان Morpholino على الجليد وإعداد محلول الحقن بحيث يتم حقن 400 بيكوغرام من مورفولينو لكل بيضة باستخدام طرف ماصة مايكرولودر طويلة أو إضافة اثنين إلى أربعة مصغرة bolus إلى النهاية. عندما تم تحميل كل من الإبر، واستخدام ملقط لتقليم طول الزائد من نصائح حقن إبرة وجبل الإبرة الأولى في micromanipulator متصلة حاقن دقيق picoliter.
ثم، ضع طبق الحقن تحت مجهر تشريح واستخدام micromanipulator لاختراق كل بيضة مع الإبرة قبل حقن نانولتر واحد من محلول حقن مورفولينو مباشرة في صفار. لحقن CRISPR، مزيج 25 picograms من الجيش الملكي النيبالي دليل مع 300 picograms من البروتين كريسبر المرتبطة 9 RNA رسول وحقن اثنين من nanoliters من محلول الحمض النووي الريبي الناتجة في كل جنين كما هو موضح. ل Tol2 transposase و Tol2 يحيط حقن البلازميد، والجمع بين 25 نانوغرام لكل ميكرولتر من TOL2 رسول الجيش الملكي النيبالي مع 25 نانوغرام لكل ميكرولتر من بناء Tol2 plasmid والفينول الأحمر في المياه الخالية من RNase.
ثم حقن نانولتر واحد من الحل في كل جنين كما أظهرت للتو. لفحص الحيوانات التي حقنها مورفولينو في حقن بعد أربعة أيام ، اعتمادا على جينة من الفائدة ، تصور يرقات الأسماك تحت مجهر ستيريو لمراقبة النمط الظاهري للحيوانات المحقونة أو سجل الفيديو لقياس السلوك. لفحص لـ CRISPR indels، نقل الأجنة التي حقنها CRISPR في أنابيب PCR واستخراج الحمض النووي وفقا لبروتوكولات استخراج الحمض النووي القياسية لتفاعل سلسلة البوليميراز أو تحليل PCR.
لتقييم الطفرات، تشغيل خمسة ميكرولترات من المنتج PCR على جل agarose 3٪ في 70 فولت لمدة ثلاث ساعات. سوف البرية من النوع، والحمض النووي غير المطفرة يؤدي إلى الفرقة متميزة، في حين أن الحمض النووي متحولة سيؤدي إلى عصابة تشويه. كهف مكسيكي حقنت مع مراقبة مورفولينو معارض أكثر بكثير النشاط الحركي وانخفاض النوم على مدى 24 ساعة، مقارنة مع الأسماك السطحية حقنت مع مورفولينو مخفوق.
حقن أوريكسين أوريكسين مورفولينو له تأثير ضئيل على النوم في الأسماك السطحية مقارنة بالأسماك التي يتم حقنها بالتحكم. وعلى النقيض من ذلك، فإن نقص السكر أو الاكسين عن طريق حقن مورفولينو له تأثير كبير على النوم في الأسماك التي تعيش في الكهوف، مما يوفر صلة مباشرة بين تعبير أوريكسين أو ما هو المهووس. CRPSR بوساطة mutagenesis من الجين المهق OCA2 في نتائج الأسماك السطحية في بعض الأفراد homozygous لaoca2 البرية من النوع الأليل إيجابية، ويرتبط مع إيواء التصبغ، في حين أن الأفراد الذين لديهم نسختين من الأليل OCA2 OCA2 متحور كريسبر هي المهق، وتوفير صلة مباشرة بين الجين OCA2 متحولة والمهق في أسماك الكهف.
حدد F0 'sالجابية لTransgene Tol2 المنقولة إلى الوراء عبر إلى نوع البرية لتوليد خطوط F1 مستقرة. وهذا يتيح حية تصوير الكالسيوم للكشف عن الاختلافات في نشاط الخلايا العصبية، والتوسط التغيرات السلوكية في بيئة الكهف، ووضع الأساس للتعبير عن العديد من transgenes إضافية لتوصيف والتلاعب وظيفة الجينات في المكسيكية. أهم الأشياء التي يجب تذكرها هي تحميل البيض بإحكام على اللوحة ، وتقليم الإبرة بشكل صحيح ، وتحسين الحقن المجهري.
بعد نجاح الضربة القاضية الجينية، والتكامل transgene، أو تحرير الجينات كريسبر بوساطة، يمكن استخدام هذه الأسماك لتحليلات النمو والسلوكي ونشاط الدماغ.
