تسمح هذه الطريقة بالنمذجة الدقيقة لطفرات اكتساب الوظيفة المتكررة لسرطان الدم في الخلايا الجذعية والسلفية البشرية الأولية المكونة للدم وبالتالي التحقيق في الدور في تحول اللوكيميا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن هندسة الطفرات القائمة على CRISPR-Cas9 يتم دمجها مع إدخال مراسل الفلورسنت. وهذا يسمح بشكل فريد بتحديد وإثراء وتتبع مجموعات الخلايا المتحورة غير المتجانسة النقية.
سيوضح الإجراء توماسو سكونوكيا ، زميل أبحاث ما بعد الدكتوراه من مختبري. للبدء ، صمم الحمض النووي الريبي الدليلي الفردي باستخدام أداة تصميم Benchling عبر الإنترنت عن طريق تحديد خيار إنشاء علامة الجمع. ثم ، انقر فوق تسلسل الحمض النووي "متبوعا باستيراد تسلسل الحمض النووي" والاستيراد من قواعد البيانات "اختيار.
ثم أدخل الجين المطلوب وحدد الإنسان"كنوع. انقر فوق خيار البحث وحدد استيراد النص الصحيح. حدد المنطقة محل الاهتمام التي تريد تقديم فاصل حبلا مزدوج.
ثم حدد خيار CRISPR "على الجانب الأيمن من الشاشة ، متبوعا بأدلة التصميم والتحليل. بعد ذلك ، حدد دليلا واحدا "مع الحفاظ على طول الدليل إلى 20 زوجا أساسيا وتسلسل PAM للتحرير باستخدام SP-Cas9. اختر دليلا بدرجة عالية على الهدف ودرجة عالية خارج الهدف واطلب الحمض النووي الريبي الدليلي الفردي كدليل RNA أحادي اصطناعي معدل كيميائيا من بائع تجاري.
لتصميم قالب HDR ، قم باستيراد التسلسل الجينومي وتسلسل الترميز إلى برنامج للاستنساخ الجزيئي. من ملف التسلسل الجينومي ، صمم ذراع التماثل الأيسر عن طريق تحديد ، من الناحية المثالية ، 400 زوج أساسي على الطرف الأول الخمسة من فواصل الشريط المزدوج والصق هذا التسلسل في ملف جديد. من ملف التسلسل الجينومي ، صمم تسلسل مستقبل لصق عن طريق تحديد آخر 150 زوجا أساسيا من intron المستهدف ولصقه بعد ذراع التماثل الأيسر.
من ملف تسلسل الترميز ، حدد cDNA محل الاهتمام. يعمل الكودون على تحسين cDNA وإدخاله بعد تسلسل متقبل اللصق. بعد cDNA محل الاهتمام ، أدخل إشارة polyadenylation ثلاثية أولية بعد تسلسل المروج للبروتين الفلوري.
بعد ذلك ، أدخل تسلسل البروتين الفلوري وإشارة polyadenylation ثانية ولكن مختلفة. من ملف التسلسل الجينومي ، صمم ذراع التماثل الأيمن عن طريق اختيار 400 زوج أساسي بشكل مثالي على الطرف الرئيسي الثلاثة لفواصل الشريط المزدوج وأدخل التسلسل بعد polyadenylation الثاني. بعد ذلك ، قم بإنشاء نسخة من القالب بأكمله وقم بتعديل cDNA محل الاهتمام بحيث يحتوي على تسلسل الطفرة المطلوبة.
استبدل بروتين الفلورسنت ببروتين فلوري مختلف. إنشاء واستنساخ قوالب HDR في متجه تعبير AAV. لإعداد AAV6 المؤتلف ، قم بإعداد 10 أطباق 150 ملم يحتوي كل منها على 11 مليون HECK293T في 20 ملليلتر من DMEM مكملة ب 10٪ FBS و 1٪ بنسلين ستربتومايسين و 25 ملليمولار HEPES.
ثم ضع الأطباق في الحاضنة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، لمدة 24 ساعة. بعد التخلص بعناية من الوسط القديم ، استبدله ب 20 ملليلتر من DMEM الخالي من المضادات الحيوية المكمل ب 10٪ FBS و 25 ملليمولار HEPES وواحد مليمولار زبدات الصوديوم. بعد ذلك، قم بإعداد أنبوبين سعة 15 ملليلترا مكتوب عليهما أنبوبان واحد واثنان.
للأنبوب الأول ، أضف خمسة ملليلتر من وسط المصل المختزل ، و 60 ميكروجراما من بلازميد HDR المتحور AAV6 المؤتلف ، و 220 ميكروجراما من البلازميد المساعد PDGM6. إلى الأنبوب الثاني ، أضف خمسة ملليلتر من وسط المصل المختزل و 1120 ميكرولتر من ملليغرام واحد لكل ملليلتر من محلول أمين البولي إيثيلين. بعد إضافة محتويات الأنبوب الثاني إلى الأنبوب الأول ، دوامة لمدة 30 ثانية ، ثم احتضانها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
أضف بعناية 1.1 ملليلتر من المحلول إلى كل طبق ووزعه عن طريق الدوران برفق. ضع الأطباق في الحاضنة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، لمدة 48 ساعة. ثم أضف 250 ميكرولتر من 0.5 مولار EDTA إلى كل طبق وضعها في الحاضنة لمدة 10 دقائق.
احصد الخلايا عن طريق غسلها من الطبق ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي سعة 500 ملليلتر. جهاز طرد مركزي عند 2000 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية. قم بفك الحبيبات عن طريق الدوامة واستخراج الفيروس باستخدام مجموعة تنقية AAV.
بعد نقث الفيروس المنقى ، قم بتخزينه في 80 درجة مئوية تحت الصفر. بعد إذابة الخلايا الجذعية والسلفية المكونة للدم الإيجابية CD34 ، انقل الخلايا إلى 10 ملليلتر من RPMI الدافئ مسبقا مع 1٪ بنسلين ستربتومايسين. جهاز طرد مركزي عند 350 جم في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
تعليق الخلايا في الجذعية المكونة للدم ووسط الاحتفاظ بالخلايا السلفية إلى تركيز 250،000 خلية لكل ملليلتر واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 72 ساعة. بعد ذلك ، احصد الخلايا في أنبوب سعة 15 ملليلتر. عد وتحقق من صلاحية الخلية عن طريق استبعاد تريبان الأزرق.
لتحضير مركب البروتين الريبي ، أضف 15 ميكروغرام من Cas9 وثمانية ميكروغرام من الحمض النووي الريبي أحادي التوجيه في أنبوب 1.5 ملليلتر واحتضانه عند 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في كتلة تسخين. أثناء احتضان مركب البروتين النووي الريبي ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 350 جم لمدة خمس دقائق وتخلص من المادة الطافية. بعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من محلول nucleofection ، امزج الخلايا مع مركب البروتين النووي الريبي وانقلها إلى كوفيت.
بعد النقر برفق على الكوفيت لإزالة أي فقاعات هواء متبقية ، أدخل الكوفيت في حامل نظام النقل وقم بالكهرباء بالخلايا. مباشرة بعد التثقيب الكهربائي ، أضف 400 ميكرولتر من الجذعية المكونة للدم الدافئة مسبقا ووسط الاحتفاظ بالخلايا السلفية بدون بنسلين ستربتومايسين وانقل الخلايا باستخدام ماصة نقل دقيقة إلى صفيحة استزراع تحتوي على جذع مكون للدم قبل التسخين ووسط الاحتفاظ بالخلايا السلفية بدون بنسلين ستربتومايسين. ثم نقل اللوحة إلى الحاضنة.
قم بإذابة القوارير التي تحتوي على AAVs المؤتلف المجمدة على الجليد وقم بتحويل الخلايا عن طريق سحب الكمية المثلى من كل AAV6 المؤتلف إلى تعليق الخلية. بعد خلط معلق الخلية برفق مع الماصة ، احتضن الخلايا المحولة لمدة ست إلى ثماني ساعات عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد ست إلى ثماني ساعات ، اجمع الخلايا في أنبوب وطرد مركزي لها عند 350 جم في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.
تخلص من المادة الطافية واستبدلها بجذع جديد مكون للدم ووسط احتفاظ بالخلايا السلفية مكمل ببنسلين ستربتومايسين ونقل الخلايا إلى صفيحة زراعة الخلايا. احتضان الخلايا لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. لفرز الخلايا المهندسة التي تحمل طفرة اكتساب الوظيفة غير المتجانسة ، قم بحصاد الخلايا في أنبوب سعة 15 ملليلتر وأجهزة طرد مركزي عند 350 جم في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق كما هو موضح سابقا.
قم بإزالة المادة الطافية وتعليق الخلايا في ملليلتر واحد من DPBS التي تحتوي على 0.1٪ PSA وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى عند 350 جم في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد التخلص من المادة الطافية ، قم بتعليق الخلايا في حجم مناسب من DPBS بالإضافة إلى 0.1٪ BSA اعتمادا على رقم الخلية كما هو موضح سابقا. انقل الخلايا إلى أنبوب فاكس معقم مزود بغطاء وأضف سبعة AAD أو صبغة صلاحية أخرى إلى معلق الخلية لاستبعاد الخلايا الحية / الميتة.
فرز الخلايا الحية التي تكون إيجابية مزدوجة لبروتينات مراسل الفلورسنت في أنبوب تجميع يحتوي على 200 ميكرولتر من الجذع المكونة للدم ووسط الاحتفاظ بالخلايا السلفية. بعد الطرد المركزي للخلايا المصنفة عند 350 جم في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق كما هو موضح سابقا ، إلى تركيز 250،000 خلية لكل مليلتر لمزيد من التوسع في الثقافة أو استخدام الخلايا مباشرة للمقايسات الوظيفية. بعد يومين من النقل مع مركب البروتين النووي الريبي والنقل مع فيروسات AAV6 المؤتلفة ، تم تحليل الخلايا عن طريق قياس التدفق الخلوي.
تم الكشف عن أربع مجموعات رئيسية ، بما في ذلك الخلايا التي لا تحتوي على تحرير الجينوم القائم على HDR والتي لا تعبر عن GFP ولا خلايا BFP الإيجابية فقط ل GFP مع دمج النوع البري فقط ، والخلايا الإيجابية فقط ل BFP مع دمج البنية المتحورة فقط ، والخلايا الإيجابية المزدوجة GFP و BFP مع دمج كل من النوع البري والتسلسلات المتحورة. للتحقق من صحة الضربة القاضية الناجحة لطفرات الكالريتيكولين غير المتجانسة في / خارج PCR تم إجراؤه على الحمض النووي الجينومي المستخرج من الخلايا المحتضنة باستخدام AAV فقط ومن الخلايا المحتضنة بالبروتين النووي الريبي و AAV مع نوع الكالريتيكولين البري المضطرب وتسلسل حذف الكالريتيكولين. تم فرز الخلايا بناء على التعبير المتزامن لكل من مراسلي التألق قبل استخراج الحمض النووي.
بعد الرحلان الكهربائي الهلامي ، تم استئصال العصابات الفردية من الجل وتم استخراج الحمض النووي لتسلسل سانجر اللاحق. أكدت نتائج التسلسل التكامل السلس الناجح للنوع البري والتسلسلات المتحورة في الخلايا الجذعية والسلفية المكونة للدم غير المتجانسة الزيجوت. أهم شيء يجب تذكره عند محاولة هذا الإجراء هو اختيار الحمض النووي الريبي الموجه الفردي الأفضل أداء بعناية ، حيث سيحدد ذلك كفاءة HDR الإجمالية ، وبالتالي تكرار الضربة القاضية الناجحة للطفرات غير المتجانسة.
بعد هذا الإجراء ، يمكن استخدام الخلايا المعدلة وراثيا في التجارب الوظيفية في المختبر وفي الجسم الحي مثل فحوصات وحدة تشكيل المستعمرة ، ومقايسات التمايز ، والزرع في الفئران التي تعاني من نقص المناعة.
