Questo metodo consente la modellazione precisa delle mutazioni leucemogeniche ricorrenti con guadagno di funzione nelle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche umane primarie e quindi di studiare il ruolo nella trasformazione leucemica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'ingegneria mutazionale basata su CRISPR-Cas9 è combinata con l'introduzione di un reporter fluorescente. Ciò consente in modo univoco l'identificazione, l'arricchimento e il monitoraggio di popolazioni cellulari pure eterozigoti mutate.
A dimostrare la procedura sarà Tommaso Sconocchia, ricercatore post-dottorato del mio laboratorio. Per iniziare, progetta il singolo RNA guida utilizzando lo strumento di progettazione online Benchling selezionando l'opzione più creazione. Quindi, fare clic su sequenza di DNA "seguito da importare sequenze di DNA "e importare da database" opzione.
Quindi inserisci il gene desiderato e seleziona "umano" come specie. Fare clic sull'opzione "cerca" e selezionare l'importazione della trascrizione corretta. Selezionare la regione di interesse in cui introdurre l'interruzione del doppio filamento.
Quindi seleziona l'opzione "CRISPR" sul lato destro dello schermo, seguita dalle guide di progettazione e analisi. Quindi, selezionare la guida singola mantenendo la lunghezza della guida a 20 coppie di basi e la sequenza PAM per la modifica con SP-Cas9. Scegli una guida con un alto punteggio on-target e un alto off-target score e ordina il singolo RNA guida come RNA guida singolo sintetico chimicamente modificato da un fornitore commerciale.
Per progettare il modello HDR, importare la sequenza genomica e la sequenza di codifica nel software per la clonazione molecolare. Dal file di sequenza genomica, progettare il braccio di omologia sinistro selezionando, idealmente, 400 coppie di basi sulle cinque estremità prime delle interruzioni del doppio filamento e incollare questa sequenza in un nuovo file. Dal file della sequenza genomica, progettare la sequenza accettore di giunzione selezionando le ultime 150 coppie di basi dell'introne mirato e incollandolo dopo il braccio di omologia sinistro.
Dal file della sequenza di codifica, selezionare il cDNA di interesse. Codone ottimizza il cDNA e lo inserisce dopo la sequenza accettore di giunzione. Dopo il cDNA di interesse, inserire un segnale di poliadenilazione a tre primi seguendo una sequenza promotore per la proteina fluorescente.
Quindi, inserire la sequenza per la proteina fluorescente e un secondo, ma diverso segnale di poliadenilazione. Dal file di sequenza genomica, progettare il braccio di omologia destro selezionando idealmente 400 coppie di basi sulle tre estremità prime delle rotture del doppio filamento e inserire la sequenza dopo la seconda poliadenilazione. Quindi, crea una copia dell'intero modello e modifica il cDNA di interesse in modo che contenga la sequenza della mutazione desiderata.
Scambiare la proteina fluorescente con una diversa proteina fluorescente. Costruisci e clona i modelli HDR nel vettore di espressione AAV. Per la preparazione ricombinante di AAV6, preparare 10 piatti da 150 millimetri contenenti ciascuno 11 milioni di HECK293T in 20 millilitri di DMEM integrato con 10% FBS, 1% penicillina streptomicina e 25 HEPES millimolare.
Quindi, posizionare i piatti nell'incubatrice a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica, per 24 ore. Dopo aver accuratamente scartato il vecchio mezzo, sostituirlo con 20 millilitri di DMEM privo di antibiotici integrato con 10% FBS, 25 millimolari HEPES e un millimolare di sodio butirrato. Quindi, preparare due tubi da 15 millilitri etichettati tubi uno e due.
Per il primo tubo, aggiungere cinque millilitri di mezzo sierico ridotto, 60 microgrammi di plasmide HDR ricombinante con mutazione AAV6 e 220 microgrammi di plasmide helper PDGM6. Al tubo due, aggiungere cinque millilitri di mezzo sierico ridotto e 1120 microlitri di un milligrammo per millilitro di soluzione di polietilenammina. Dopo aver aggiunto il contenuto del tubo due al tubo uno, vortice per 30 secondi, quindi incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
Aggiungere con cautela 1,1 millilitri di soluzione a ciascun piatto e distribuire ruotando delicatamente. Posizionare i piatti nell'incubatrice a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica, per 48 ore. Quindi aggiungere 250 microlitri di EDTA molare 0,5 a ciascun piatto e metterli nell'incubatore per 10 minuti.
Raccogliere le cellule lavandole via dal piatto e trasferirle in una provetta da centrifuga da 500 millilitri. Centrifugare a 2000 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius ed eliminare il surnatante. Allentare il pellet vorticando ed estrarre il virus utilizzando un kit di purificazione AAV.
Dopo aver aliquotato il virus purificato, conservarlo a meno 80 gradi Celsius. Dopo aver scongelato le cellule staminali e progenitrici ematopoietiche CD34 positive, trasferire le cellule in 10 millilitri di RPMI preriscaldato integrato con streptomicina all'1% di penicillina. Centrifugare a 350 g a temperatura ambiente per 10 minuti.
Sospendere le cellule nel terreno di ritenzione delle cellule staminali ematopoietiche e progenitrici ad una concentrazione di 250.000 cellule per millilitro e incubare a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 72 ore. Quindi, raccogliere le cellule in un tubo da 15 millilitri. Contare e controllare la vitalità cellulare mediante esclusione del blu tripano.
Per preparare il complesso ribocucleoprotein, aggiungere 15 microgrammi di Cas9 e otto microgrammi di RNA guida singola in un tubo da 1,5 millilitri e incubare a 25 gradi Celsius per 10 minuti in un blocco riscaldante. Mentre il complesso ribonucleoproteico è in incubazione, centrifugare le cellule a 350 G per cinque minuti e scartare il surnatante. Dopo aver sospeso le cellule in 100 microlitri di soluzione di nucleofezione, mescolare le cellule con il complesso ribonucleoproteico e trasferirle nella cuvetta.
Dopo aver picchiettato delicatamente la cuvetta per rimuovere eventuali bolle d'aria residue, inserire la cuvetta nel supporto del sistema di trasfezione ed elettropora le celle. Immediatamente dopo l'elettroporazione, aggiungere 400 microlitri di terreno di ritenzione delle cellule staminali e progenitori ematopoietici preriscaldati senza streptomicina della penicillina e trasferire le cellule con una pipetta di trasferimento fine in una piastra di coltura contenente staminali ematopoietiche preriscaldate e terreno di ritenzione delle cellule progenitrici senza streptomicina penicillina. Quindi trasferire la piastra nell'incubatore.
Scongelare i flaconcini contenenti gli AAV ricombinanti congelati su ghiaccio e trasdurre le cellule pipettando la quantità ottimale di ciascun AAV6 ricombinante nella sospensione cellulare. Dopo aver mescolato delicatamente la sospensione cellulare con la pipetta, incubare le cellule trasdotte per sei-otto ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo sei-otto ore, raccogliere le cellule in una provetta e centrifugarle a 350 G a temperatura ambiente per cinque minuti.
Scartare il surnatante e sostituirlo con un terreno di ritenzione di cellule staminali ematopoietiche e progenitrici preriscaldato fresco integrato con streptomicina penicillina e trasferire le cellule in una piastra di coltura cellulare. Incubare le cellule per 48 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Per selezionare le cellule ingegnerizzate portatrici della mutazione eterozigote con guadagno di funzione, raccogliere le cellule in un tubo da 15 millilitri e centrifugare a 350 G a temperatura ambiente per cinque minuti, come dimostrato in precedenza.
Rimuovere il surnatante e sospendere le cellule in un millilitro di DPBS contenente 0,1% PSA e centrifugare nuovamente a 350 G a temperatura ambiente per cinque minuti. Dopo aver eliminato il surnatante, sospendere le cellule in un volume appropriato di DPBS più 0,1% BSA a seconda del numero di cellule come dimostrato in precedenza. Trasferire le cellule in un tubo fax sterile dotato di un cappuccio e aggiungere sette AAD o altro colorante di vitalità alla sospensione cellulare per l'esclusione di cellule vive / morte.
Ordinare le cellule vive che sono doppiamente positive per le proteine reporter fluorescenti in una provetta contenente 200 microlitri di staminali ematopoietiche e mezzo di ritenzione delle cellule progenitrici. Dopo aver centrifugato le cellule selezionate a 350 G a temperatura ambiente per cinque minuti come dimostrato in precedenza, ad una concentrazione di 250.000 cellule per millilitro per un'ulteriore espansione in coltura o utilizzare le cellule direttamente per saggi funzionali. Due giorni dopo la trasvezione con il complesso ribonucleoproteico e la trasduzione con i virus AAV6 ricombinanti, le cellule sono state analizzate mediante citometria a flusso.
Sono state rilevate quattro popolazioni principali, tra cui cellule senza editing del genoma basato su HDR che non esprimono né la GFP né le cellule BFP positive solo per GFP con solo il costrutto wild type integrato, cellule positive solo per BFP con solo il costrutto mutato integrato e GFP e BFP cellule doppie positive con entrambe le sequenze wild type e mutate integrate. Per convalidare il successo del knock-in delle mutazioni eterozigoti della calreticolina in/out la PCR è stata eseguita su DNA genomico estratto da cellule incubate solo con AAV e da cellule incubate con la ribonucleoproteina e AAV con la sequenza knocked-in calreticulin wild type e delezione della calreticulina. Le cellule sono state ordinate in base all'espressione simultanea di entrambi i reporter di fluorescenza prima dell'estrazione del DNA.
Dopo l'elettroforesi su gel, le singole bande sono state asportate dal gel e il DNA è stato estratto per il successivo sequenziamento Sanger. I risultati del sequenziamento hanno confermato il successo dell'integrazione senza soluzione di continuità del tipo selvatico e delle sequenze mutate nelle cellule staminali ematopoietiche e progenitrici eterozigoti mutate con calreticulina. La cosa più importante da ricordare quando si tenta questa procedura è selezionare attentamente l'RNA guida singola con le migliori prestazioni, in quanto ciò determinerà l'efficienza complessiva dell'HDR e, quindi, la frequenza di knock-in di successo delle mutazioni eterozigoti.
Seguendo questa procedura, le cellule geneticamente modificate possono essere utilizzate per esperimenti funzionali in vitro e in vivo come saggi unitari formanti colonie, saggi di differenziazione e trapianto in topi immunodeficienti.
