يوفر هذا البروتوكول طريقة وظيفية طويلة الأجل ، في المختبر ، لتقييم مستقبلات مستضدات التشيمير ، أو خلايا CAR T ، من خلال تحدي الخلايا السرطانية المتكررة. هذه التقنية هي أقل استهلاكا للوقت، وأقل كثافة في العمل مما كانت عليه في تقييم الخلايا T CAR vivo مع تحقيق تمثيل دقيق للفعالية المضادة للورم الحقيقي. هذه التقنية في المختبر تمكن من فحص الإنتاجية العالية والتمايز من CAR T الخلية المضادة للأورام قوة.
التي لديها التطبيق المحتمل لتقييم الفعالية السريرية للمنتجات الخلايا CAR T. تبدأ من قبل فصل الأورام الأرومية الدبقية من ثقافة أورام ورم الأرومية الدبقية. مع ملليلتر واحد من accutase الباردة، و 30 إلى 60 ثانية من الأنابيب.
عندما تعطلت أورامpheres، ووقف رد الفعل مع خمسة ملليلتر من الحارة المشتركة في الثقافة المتوسطة. وبليه تعليق الخلايا السرطانية عن طريق الطرد المركزي. إعادة تعليق خلايا الورم الأرومي الدبقي إلى 1.6 مرة 10 إلى الخلايا السرطانية الخامسة لكل ملليلتر من التركيز المتوسط لزراعة الخلايا التكميلية الطازجة، وتمييع الخلايا التائية التي تم حصادها من خلية CAR T إلى النسبة المئوية المناسبة من الخلايا T إيجابية CAR لكل ملليلتر من التركيز المتوسط المشترك.
بعد ذلك، إضافة 100 ميكرولترات من الخلايا السرطانية المخففة إلى كل بئر من 96 بئر مسطح جيدا أسفل الأنسجة لوحة الثقافة. و 100 ميكرولترات من خلايا CAR T في كل بئر من الخلايا السرطانية مع خلط لطيف. ثم ضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
في أيام اثنين وأربعة وستة من الثقافة، وإزالة بعناية 50 ميكرولترات من المتوسط من كل بئر من الخلايا السرطانية، T الخلية المشتركة في الثقافة لوحة المقرر ل rechallenge وفقا للجدول. ثم، إضافة 50 ميكرولترات من تعليق الخلايا الأرومية جديدة، أعدت كما أظهرت للتو، ولكن مع ضعف عدد الخلايا من الثقافة المشتركة الأولية لكل بئر مع خلط لطيف. وإرجاع اللوحة إلى حاضنة ثقافة الخلية.
أيام واحدة وثلاثة وخمسة وسبعة من الثقافة المشتركة، ونقل supernatant من كل بئر ليتم حصادها في لوحة جديدة 96 جيدا جولة أسفل وفقا للطاولة وإضافة 50 ميكرولترات من قبل warmed 0.5٪ EDTA تريبسين في كل المتوسطة استنفدت جيدا. بعد خمس دقائق في 37 درجة مئوية، تأكد من أن الخلايا قد فصلت من أسفل كل بئر عن طريق المجهر الخفيفة، وماص بلطف محلول الإنزيم حول الجزء السفلي من كل بئر لإعادة تثبيت الخلايا. قبل نقل تعليق الخلية المنفصلة إلى الآبار المناسبة المقابلة لصفيحة 96 بئرًا جديدة.
بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي، وغسل الخلايا مع 200 ميكرولترات من الفلورسنت تنشيط الخلية فرز حل دائم، أو FFS في بئر مع الطرد المركزي الثاني. إعادة تعليق الكريات في 100 ميكرولترات من كوكتيل الأجسام المضادة من الاهتمام في 100 ميكرولترات من SSS لكل بئر لاحتضان 30 دقيقة في أربع درجات مئوية. A نهاية الحضانة إزالة أي جسم مضاد غير منضم من قبل 100 و 200 ميكرولتر FSS يغسل وإعادة تعليق الخلايا في 100 إلى 200 ميكرولترات من وصمة عار DAPI النووية و FSS.
ثم، تحليل الخلايا وفقا لبروتوكولات التحليل السيتوميتري تدفق القياسية. للتحليل الوظيفية والفينوتيبيك من الخلايا تي CAR بعد الخلايا السرطانية المشتركة الثقافة، واسترداد ملفات البيانات من جهاز قياس التدفق، وبوابة كل من الخلايا السلبية DAPI الحية. لتحديد كمية الخلايا السرطانية، بوابة السكان السلبية CD45.
لتحديد كمية الخلايا T CAR بوابة CD45 إيجابية الجسم. ثم رسم الورم وأرقام الخلايا T CAR على مدى الوقت من التجربة، وتحديد تفعيل الخلية T من خلال التعبير المشترك من 41BB، وD69. استنفاد الخلية T بواسطة التعبير PD1 و LAG3 و TIM3 وحالة ذاكرة الخلية T LAG3 و TIM3 وحالة ذاكرة الخلية T بواسطة CD45RO والتعبير يغاند CD62.
بواسطة CD45RO، وتعبير CD62 يغاند. كل CD4 إيجابية, وCD8 خلايا T إيجابية تصبح تنشيط بالتساوي ضد خلايا الورم الأرومي الدبقي التي تعبر عن المستضد الهدف كما هو مبين من قبل التعبير cd107a والخلايا الخلوية. ومع ذلك، كما تم تقييمها من قبل تحدي الورم المتكرر SA، CD4 إيجابية، ولكن ليس CD8 إيجابية، خلايا CAR T قادرة على القتل جولة متعددة.
كما تحقق خلايا CD4 T إيجابية من CAR توسعًا أكثر قوة. عندما CD4 إيجابية, و CD8 خلايا T إيجابية CAR مختلطة في نسبة واحد إلى واحد, هذا التركيبة الخلية من ينفذ CD8 إيجابية, ولكن ليس CD4 إيجابية CAR T الخلايا من حيث السمية الخلوية على المدى الطويل. بالإضافة إلى ذلك ، يتم حث توسع خلايا CD8 T إيجابية من خلال إضافة خلايا T إيجابية CD4.
بينما CD4 إيجابية يتم تثبيط توسيع الخلايا T CAR في وجود الخلايا الإيجابية CDa. بعد 24 ساعة من الثقافة المشتركة الأولية ، يتم تنشيط كلا من CD4 إيجابية وCD8 إيجابية خلايا T CAR بالمثل. خلال التحدي المتكررة الورم, كل CD4 إيجابية و CD8 إيجابية خلايا T CAR تثبت الانتقال من CD45RO إيجابية, CD62 ligan النمط الظاهري الذاكرة المركزية الإيجابية, إلى CD45RO إيجابية CD62 إيجابية النمط الظاهري الذاكرة السلبية.
CD8 إيجابية خلايا T CAR هي أيضا أكثر عرضة للإرهاق مقارنة مع خلايا CD4 T إيجابية CAR كما تم تقييمها من قبل PD1, LAG3, و TIM3 التعبير بعد ثلاثة أيام من ثقافة المشتركة. وعلاوة على ذلك, لا توجد اختلافات لوحظت في CDa إيجابية CAR T خلية استنفاد في وجود أو عدم وجود خلايا T إيجابية CD4, تشير إلى أن CD4 الناجمة CD8 إيجابية توسيع الخلايا T CAR لا يرتبط مع وظيفة أفضل effector. ويمكن أيضا أن يقترن هذا المقال مع فرز الخلايا التائية تشكل ثقافة المشاركة لإجراء مزيد من التحليل على transcriptomes، proteomics، والجينات المحددة ذات الاهتمام.
ويمكن أيضا أن تستخدم هذا التحدي الورم المتكررة كمنصة للتحقيق في الأحداث البيولوجية بعد التعرف على ورم الخلايا CAR T.
