وقد لوحظت المجتمعات البكتيرية داخل الخلايا، أو الحاويات الوسيطة، في الفئران التي أعطيت التهابات المسالك البولية التجريبية، أو التهابات المسالك البولية. كما أنها شوهدت في رواسب البول من المرضى UTI الإنسان. التقنية التي نوصفها اليوم هي طريقة لعزل IPCs واحدة من الفئران المصابة تجريبيا.
تقنية الخفق المجهري للفم هي التقنية الوحيدة المتاحة حاليًا لعزل البكتيريا داخل الخلايا من مثانات الماوس المصابة. لإعداد ماصات الفم الزجاجية ، قرصة بحزم طرفي أنبوب الشعرية الزجاجية وتدوير بالتساوي منتصف الأنبوب ذهابا وإيابا على طول محورها على مصدر اللهب المفتوح. عندما يصبح الزجاج لينة، وإزالة الشعيرات الدموية من مصدر الحرارة وسحب الزجاج على الفور بعيدا.
الطول النهائي المثالي للشعر الشعري المسحوب هو ثلاثة إلى خمسة سنتيمترات أطول من الشعيرات الدموية دون عقاب لضمان قطر داخلي مناسب لعزل الخلايا الظهارية المفردة في المثانة. عندما يبرد الزجاج، تحقق لمعرفة ما إذا كان منتصف الشعيرات الدموية الزجاجية أضيق وأن الجزء الداخلي من الأنبوب لا يزال أجوف. التقاط نهاية كبيرة من الشعيرات الدموية سحبت بيد واحدة، واستخدام ملقط لفهم ما يصل شعرية في أضيق نقطة لها، والتأكد من أن تمارس ملقط مع ما يكفي من القوة لقبضة الشعيرات الدموية بحزم دون سحق ذلك.
تطور بسرعة ملقط لالتقاط الشعيرات الدموية سحبت في أضيق نقطة. ثم، ضع الشعر الشعري بحجم ميكروبيت الفم في طبق بيتري عيار 100 ملليمتر وقم بتعقيم الطبق للأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة. لحصاد المثانة، ضع فأرًا في موضع الوبين وأعقم منطقة البطن بنسبة 70٪ من الإيثانول.
باستخدام ملقط الإيثانول المعقم والمقص الجراحي، وجعل شق الجلد عرضية سنتيمتر واحد الأولية فوق فتحة مجرى البول وتوسيع شق قطريا نحو الأطراف العليا من الماوس لخلق قطع على شكل حرف V على طول الأمامي بأكمله من الماوس الذي يعرض محتويات الصفاق. باستخدام أدوات جديدة معقمة، ادفع بلطف على منصات الدهون بالقرب من منطقة الحوض من الماوس للتسبب في المثانة لبرز وفهم المثانة المكشوفة في القمة. الحفاظ على قبضة صارمة على المثانة، وقطع الحالب ومجرى البول لتحرير المثانة وإدراج غيض من رمح واحد من ملقط مدورة في فتحة المثانة حيث كان مجرد incised.
الافراج عن ملقط تجتاح قمة والحفاظ على ملقط مدورة مغلقة تماما تقريبا، واستخدام زوج الثاني من ملقط لسحب بلطف الطرف الخارجي للمصب من المثانة بعيدا عن ملقط مدورة وحولها وعلى الطرف الآخر من ملقط مدورة لتحويل المثانة الداخل إلى الخارج. ثم، استخدم الزوج الثاني من ملقط لاقناع بلطف المثانة المقلوبة من غيض من ملقط في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني الباردة. وكشط بلطف طبقة الخلية الظهارية الداخلية على السطح الخارجي للمثانة المقلوبة مع اثنين من أزواج من ملقط نظيفة.
عندما تم كشط جميع الخلايا، إدراج نهاية دون عقاب من الشعرية الزجاجية سحبت في المكونات المطاطية من أنبوب الpirator وتناسب بإحكام الطرف الضيق من طرف ماصة ملليلتر واحد في الطرف الآخر المفتوحة من الأنبوب. تناسب بإحكام الطرف الضيق من ماصة التعرق ملليلتر اثنين في مفتوحة, نهاية أوسع من طرف ماصة ملليلتر واحد ووضع تعليق الخلية كشط تحت مجهر تشريح. باستخدام التكبير 20 إلى 40X، وتحديد الحاويات الوسيطة للسوائب التراكمات الفلورية الكبيرة وتراجع نهاية غرامة من الشعرية الزجاجية في أنبوب جديد من برنامج تلفزيوني لثانية واحدة للحد من امتصاص حجم غير المرغوب فيها من خلال العمل الشعري.
عندما تم تحديد موقع IBC من الفائدة، ببطء جلب الطرف المفتوح من أنبوب الشعرية نحو IBC وتطبيق قوة شفط صغيرة جدا على ماصة التعرق لتوجيه IBC في الشعرية الزجاجية. ثم، نقل الشعيرية إلى أنبوب جهاز طرد مركزي فارغ 1.5 ملليلتر وتطبيق ضغط إيجابي طفيف لطرد القطرة وBC في الأنبوب. بالإضافة إلى تأكيد وجود IBC معزولة واحدة في أنبوب جمع عن طريق المجهر تشريح، يمكن تأكيد نقاء IBC معزولة عن طريق المجهر confocal.
الخلايا المعزولة يجب أن تلطخ لكل من الإشريكية القولونية والأروبليكين وينبغي أن يكون ما بين 50 و 120 ميكرومتر في الحجم. بعد العزل، يمكن تأكيد وجود وديمومة الخلايا البكتيرية في IBC الفردية من خلال مستعمرة تشكيل وحدة الكم أو الكم البوليميراز سلسلة التفاعل لمعادلات الجينوم. وتجدر الإشارة إلى أن الخلايا الظهارية غير المصابة المعزولة مع نفس البروتوكول لا تثبت كميات قابلة للقياس الكمي من البكتيريا.
وعلاوة على ذلك، الكمّيّة النسخ العكسيّة البوليمرات تحليل تفاعل سلسلة يؤكّد وجود الجينات الجرثومية في مجموعة من الحاويات الوسيطة المعزولة والمجمّعة بشكل فردي. تأكد دائما من أن الفم micropipette يمكن التقاط وطرد السائل بسهولة. لا تتردد في تغيير الشعيرات الدموية أو الجهاز بأكمله إذا كان الفم micropipette يشعر occluded.
تسمح لنا تقنية الخفق المجهرية هذه بدراسة السكان داخل الخلايا التي تتشكل خلال عملية UTI تجريبية. بدون هذه التقنية، تلك التجمعات داخل الخلايا ستكون ملوثة بالبكتيريا خارج الخلية و يفوقها عدد يفوقها. قد تكون بعض العوامل المعدية الأخرى أكثر سهولة أو تنتقل من الإشريكية القولونية التي استخدمناها في هذا التطبيق.
في هذه الحالات، قد يكون هناك بعض عناصر التحكم الإضافية لذلك مبرر، مثل إضافة عامل تصفية أو توسيع الأنابيب، اعتماداً على التطبيق قيد الاستخدام. ويمكن بعد ذلك استخدام الحاويات الوسيطة الوسيطة المعزولة باستخدام تقنية الخفق المجهرية هذه في تحليلات الخلايا المفردة الأخرى في المصب، مثل QRTPCR أو تسلسل الحمض النووي الريبي.
