هنا ، نوضح إجراء بسيطا ومباشرا نسبيا لتجميع شبكات الأكتوميوسين المربوطة بالغشاء ودراسة الديناميات باستخدام تقنيات مجهرية ضوئية متقدمة. الميزة الرئيسية هي أن فحصنا يسمح بالإضافة المتسلسلة للبروتينات والجزيئات الصغيرة دون الإخلال بالشبكات المربوطة بالغشاء. يمكن تكييف هذه الطريقة بسهولة لدراسة البروتينات الهيكلية الخلوية الأخرى أو الشبكات المركبة.
الجزء الأكثر أهمية في البروتوكول هو التأكد من تكوين طبقة الدهون المزدوجة المدعومة بشكل صحيح ، لذلك أولا ، كان علينا إتقان هذه الخطوة قبل البدء في إضافة البروتينات الهيكلية الخلوية. للبدء ، خذ ثلاثة إلى خمسة أغطية زجاجية مستطيلة وضعها داخل جرة كوبلين. قم بتشغيل جهاز صوتي الحمام ، واضبط درجة الحرارة على 65 درجة مئوية.
املأ جرة كوبلين بمحلول تنظيف 2٪ لغمر أغطية الغطاء بالكامل ، وضعها في جهاز الصوتنة لمدة 30 دقيقة في وضع النبض الكامل. استخدم ملقط مطلي ب PTFE غير حاد لإزالة أغطية الأغطية واحدة تلو الأخرى. اشطفها جيدا بالماء المقطر ، وضعها في جرة كوبلين أخرى مملوءة باثنين من هيدروكسيد الصوديوم العادي.
قم بتقطيع الأغطية لمدة 20 دقيقة في وضع النبض الكامل. قم بإزالة الأغطية ، واشطفها جيدا بالماء المقطر ، وضعها في وعاء كوبلن آخر مملوء بالماء المقطر. قبل البدء في التجربة ، خذ الجرة في غطاء كيميائي مزود بإمدادات غاز النيتروجين.
استخدم القفازات والملقط لإزالة الأغطية لتجفيفها تحت تيار النيتروجين. جفف كلا الجانبين ، وضعه على شبكة بلاستيكية نظيفة بغطاء. ضع الصندوق مع أغطية الأغطية في مجفف لتجنب ملامسة جزيئات الغبار ، ثم خذ أنابيب PCR المعقمة وقطع أغطيتها ونصفيها المخروطيين السفليين بشفرة جراحية حادة.
خذ الأنابيب الأسطوانية نصف المقطوعة ، ضع مادة لاصقة قابلة للشفاء بالأشعة فوق البنفسجية على الحافة الملساء لكل أنبوب مقطوع ، وضعها مقلوبة على غطاء نظيف حديثا بحيث تجلس الحافة بشكل مسطح على غطاء الغطاء. لا تحرك الأسطوانة بشكل جانبي بمجرد وضعها على غطاء الغطاء لضمان عدم انسكاب الغراء في المساحة المركزية للغرفة. ضع أغطية تحمل الحجرة داخل منظف الأوزون للأشعة فوق البنفسجية مع إمداد الأكسجين والفراغ.
قم بتشغيل ضوء الأشعة فوق البنفسجية وأضيء لمدة ثلاث إلى خمس دقائق للسماح للمادة اللاصقة بالبلمرة. أخرج أغطية الغطاء واختبر الغرف بحثا عن التسرب ، وتخلص من الغرف المتسربة. اغسل كل غرفة بمحلول تشكيل SLB ، تاركا 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت في النهاية.
ضع علامة على مستوى المخزن المؤقت عند 100 ميكرولتر بعلامة دائمة ، ثم أضف ميكرولترين من كلوريد الكالسيوم المولي 0.1 إلى الغرفة ، متبوعا بثمانية ميكرولتر من محلول SUV لكل غرفة واحتضانها لمدة 15 دقيقة عند 25 درجة مئوية. قم بإزالة 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتشكيل SLB ، وترك 50 ميكرولترا فقط في غرفة العينة ، ثم أضف 100 ميكرولتر من XKMEH واحد إلى الغرفة واخلطها برفق. قم بإزالة 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت دون لمس القاع.
كرر الغسل من ثماني إلى 10 مرات بإضافة 100 ميكرولتر من XKMEH واحد وإزالة 100 ميكرولتر. أضف 10 ميكرولتر من ملليغرام واحد لكل ملليلتر بيتا كازين إلى الطبقة المزدوجة ، واخلطها برفق ، واحتضانها لمدة خمس إلى 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. اغسل بيتا كازين ثلاث مرات باستخدام XKMEH واحد ، وأعد مستوى المخزن المؤقت إلى علامة 100 ميكرولتر.
أثناء حضانة بيتا كازين ، أخرج حصة من بروتين رابط الأكتين الغشائي ل ناقص 80 درجة مئوية تذوب بسرعة عند 37 درجة مئوية ، ثم احتفظ بها على الجليد. تمييع القسمة مع عازلة تخفيف البروتين إلى تركيز micromolar واحد. أضف بروتين الرابط إلى المحلول بتركيز نهائي محدد واخلطه برفق.
احتضن لمدة 30 إلى 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، واغسل ثلاث إلى خمس مرات مع مخزن مؤقت XKMEH واحد لإزالة بروتين HSE غير المنضم. أعد مستوى المخزن المؤقت في كل غرفة إلى علامة 100 ميكرولتر. العينة جاهزة الآن للتصوير.
قم بتشغيل المجهر وليزر الإثارة وكاميرات الكشف. تأكد من محاذاة الليزر ، وتنظيف الهدف ، وأن البرنامج جاهز لالتقاط الصور. ضع الزيت على الهدف 100 مرة ، وقم بتركيب العينة على مرحلة المجهر ، وركز الهدف على الطبقة المزدوجة.
تأكد من أن موضع الليزر بحيث يخضع لانعكاس داخلي كلي على العينة. استخدم إثارة 488 نانومتر. لتحديد سلامة الطبقة الثنائية ، قم بإجراء فحص FRAP سريع عن طريق تحديد منطقة ذات أهمية على الطبقة الثنائية وتسجيل بعض الصور لمجال الرؤية باستخدام ظروف التصوير التي توفر نسبة إشارة إلى الضوضاء من خمسة إلى واحد أو أعلى.
أوقف التسجيل مؤقتا ، وأغلق الحجاب الحاجز الميداني لمجهر TIRF لتركيز شعاع ليزر مركز على منطقة دائرية صغيرة من الطبقة المزدوجة لتبييض الفلوروفورات محليا. قم بتشغيل الليزر إلى أقصى إخراج له لتبييض المنطقة الصغيرة لمدة ثلاث إلى 10 ثوان ، ثم قم بإيقاف تشغيل الليزر. أعد فتح غشاء المجال إلى نصف قطره الأصلي ، وأعد ضبط حالة التصوير مرة أخرى على إعدادات ما قبل التبييض ، واستأنف على الفور تسجيل استعادة إشارة الفلورسنت في مجال الرؤية.
تحقق مما إذا كانت الطبقة المزدوجة سائلة ، واحفظ الصور كملفات TIF نقطية 16 بت. امزج G-actin غير المسمى والموسوم بالفلورسنت بنسبة 10 إلى واحد مولار ، وقم بتعبئته ب G-buffer بحيث يكون تركيز G-actin 20 ميكرومولار. أضف عشر 10 أضعاف ME buffer إلى المزيج للحصول على حل لمرة واحدة ، واحتضانه لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.
بعد ذلك ، قم بإذابة قارورة من مخزون البروتين بسرعة عند 37 درجة مئوية ، ثم احتفظ بها على الجليد. قم بالتخفيف باستخدام G-buffers بحيث يكون تركيز بروتين السد الآن ضعف تركيزه النهائي المطلوب ، ثم أضف حجما متساويا من محلول بروتين السد المخفف إلى مزيج الأكتين. أخيرا ، أضف حجما متساويا من المخزن المؤقت المستهدف الطازج مرتين إلى مزيج التفاعل.
يجب أن يكون الحجم النهائي للمحلول أربعة أضعاف حجم مزيج الأكتين. تأكد من أن التركيز النهائي للمكونات كما هو موضح في مخطوطة النص. احتضان العينات في الظلام عند 25 درجة مئوية لمدة 45 إلى 60 دقيقة للسماح بالبلمرة.
انزع برفق خمسة أكتين مبلمر ميكرومولار بطرف ماصة حادة ، وأضفه إلى أنبوب PCR نظيف. أضف XKMEH واحدا إلى الأنبوب لجعل الحجم النهائي أكثر من 20 ميكرولتر ، واخلطه برفق لتجنب قص F-actin. من غرفة العينة المركبة ، قم بإزالة حجم متساو من المخزن المؤقت.
أضف محلول الأكتين المبلمر إلى الحجرة ، وانزع الماصة برفق لأعلى ولأسفل ثلاث مرات دون لمس الطبقة المزدوجة في الأسفل. قم بتركيب العينة على مجهر TIRF ، واتركها ترتاح لمدة 20 إلى 30 دقيقة. سجل بعض الصور من مجالات رؤية مختلفة بعد وصول إضافة F-actin إلى حالة مستقرة.
بعد 30 دقيقة من حضانة الأكتين ، قم بتركيب العينة مرة أخرى على المجهر. تحقق من الإشارة على بروتين الرابط وقنوات F-actin. اضبط ظروف التصوير إذا لزم الأمر.
حدد منطقة جيدة لتسجيل الفاصل الزمني الطويل. سجل من 10 إلى 15 إطارا بمعدل 0.1 إلى 0.2 هرتز قبل إضافة الميوسين ، وأوقف التسجيل مؤقتا. ماصة خارج الحجم المطلوب من الميوسين العضلات المعاد تدويرها اثنين من قارورة الأسهم مع طرف ماصة نهاية حادة ، وإضافة إلى أنبوب PCR المعقم نظيفة.
أضف على الفور XKMEH واحدا إلى الأنبوب لجعل الحجم أكثر من 20 ميكرولتر ، واخلطه برفق. قم بإزالة حجم متساو من المخزن المؤقت KMEH بعناية من غرفة العينة المركبة دون إزعاجها ، وأضف محلول الميوسين برفق إلى غرفة العينة. لا ماصة لأعلى ولأسفل ، لأنها سوف تزعج خيوط السطح المرتبطة.
استأنف تسجيل الفاصل الزمني على الفور ، واحفظ جميع الصور ، ثم التقط صورا خلفية لجميع القنوات باستخدام عينة عازلة فقط. احفظ جميع الصور كملفات TIF. كانت القيمة الملائمة لمعامل الانتشار 1.34 ميكرومتر مربع في الثانية ، والتي تتفق بشكل وثيق مع القيمة المحسوبة القائمة على الصيغة البالغة 1.39 ميكرومتر مربع في الثانية.
يتناسب ملف تعريف الخط بعد التبييض الضوئي وملف تعريف الاسترداد للمنطقة المبيضة مع المعادلتين الرابعة والخامسة على التوالي. كان الجزء المتحرك من طبقة الدهون المزدوجة التي تمثل جزء السكان المبيضين الذين يتعافون مرة أخرى أكبر من 0.9 ، مما يشير إلى وجود طبقة ثنائية دهنية جيدة. أدى نشاط الميوسين إلى تدفقات أكتوميوسين مقلص ظهرت في هياكل شبيهة بالفلك في الحالة المستقرة ، مما أدى إلى التجمع المحلي لمكون الغشاء المقترن.
يمكن للمرء استخدام مجموعة متنوعة من تقنيات الفحص المجهري مثل الفحص المجهري التشتت التداخلي لدراسة ديناميكيات شبكات الأكتوميوسين غير المسماة دون إحداث أي ضرر للصور ، أو استخدام الفحص المجهري الفلوري فائق الدقة. تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين المهتمين بفهم كيفية تفاعل مجمعات البروتين الغشائي مع شبكة أكتوميوسين ديناميكية لتعديل بنيتها وتكوينها.
