يحتوي الـ إندوبلاسميكي تيكولوم على مجال أنبوبي ديناميكي يتفاعل باستمرار مع الهيكل الخلوي الذي يخضع للحركة المستمرة وإعادة الترتيب. كيف تقوم وحدة ER بإنشاء هذه المؤسسة والحفاظ عليها لم يتم فهمها بالكامل بعد. هنا نقدم مسألة مريحة لتشكيل نموذج من القاعدة إلى القمة الهيكلية لـ ER ، والذي يتكون من نظام غشاء خال من البروتين مدعوم من المواد الصلبة يمكن نقله إلى شبكات الأنابيب النانوية الدهنية المعقدة.
الهيدروفيليك هو مركب عضوي للطاقة. لا يلزم تنقية البروتين واستخراج البروتين. المكونات الأساسية الوحيدة هي الركيزة الصلبة والفوسفولبيدات التي توفر نموذج ER الأساسية.
نقل حلول الدهون الذائبة إلى قارورة مقلوب 10 ملليلتر على شكل الكمثرى إضافة إلى كمية إجمالية قدرها 3000 ميكروغرام من الدهون و 300 ميكرولترات من الكلوروفورم. ثم قم بتوصيل القارورة بمبخر دوار وضعه بإمالة 45 درجة. قم بتدوير القارورة عند 24 دورة في الدقيقة داخل حمام مائي عند درجة حرارة 23 درجة مئوية لمدة ست ساعات مع انخفاض ضغط الهواء لإزالة الكلوروفورم ببطء وبشكل كامل.
بدء تقليل الضغط مباشرة بعد بدء التناوب من قبل خطوات من 20 كيلوباسكال كل دقيقتين حتى يصل الضغط 20 كيلوباسكال. بعد ست ساعات، ووقف التناوب وزيادة ضغط الهواء مرة أخرى تدريجيا من قبل خطوات من 20 كيلوباسكال كل دقيقتين حتى تصل إلى 100 كيلوباسكال. إزالة القارورة من المبخر الدوار وإضافة ثلاثة ملليلتر من برنامج تلفزيوني و 30 ميكرولترات من الجلسرين.
دوامة بلطف قارورة إلى حل الجلسرين. استخدام سدادة الزجاج ضيق الهواء لختم قارورة تحتوي على الدهون. تخزين القارورة في الثلاجة في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها لالتهاء وتورم في الأفلام الدهنية.
في اليوم التالي، sonicate الدهون مع حمام الماء بالموجات فوق الصوتية في درجة حرارة الغرفة وعلى تردد 35 كيلو هرتز حتى تحقيق تعليق الدهون قليلاً تعكر موحدة. يمكن أن يستغرق Sonication حوالي 10 إلى 30 ثانية. صوتنة طويلة تنتج الحرارة وتضر تشكيل vesical.
هذه الخطوات تسفر عن تعليق يحتوي على نوعين من الهياكل الحتوية. Vesicles multilamellar وهايوليات unilamellar العملاقة. للتخزين، تقسيم تعليق الدهون إلى 100 aliquots ميكرولتر باستخدام ما مجموعه 30 أنابيب microcentrifuge.
تخزين aliquots في الثلاجة في ناقص 20 درجة مئوية. فلاش تجميد مع النيتروجين السائل ليس من الضروري. ذوبان تعليق الدهون ونقل قطرة 4 ميكرولتر من التعليق على شريحة المجهر الزجاجي نظيفة أو زلة الغطاء.
بعد 20 دقيقة من جفاف، وسوف تنهار قطرات في فيلم دائري مسطح من الدهون التي هي مرئية للعين. إعادة هيدرات الفيلم الدهون مع ملليلتر واحد من عازلة HEPES لمدة 3 دقائق. إعداد غرفة المراقبة مع أعلى مفتوحة للسماح لتبادل العازلة عن طريق ماصة التلقائي، وهو مطلوب لبدء تحويل ER كما هو مفصل في بروتوكول النص.
بعد إزالة لوح PDMS المعالجة مع ملعقة، استخدم مشرط لقطع الإطار إلى الأبعاد والهندسة المناسبة لفتح المتاحة في مرحلة المجهر. أبعاد 1.5 في 1.5 في 0.5 سنتيمتر مناسبة لمعظم الاجهزة. جلب الجانب السلس من إطار PDMS في اتصال مع الجانب النشط من السطح حيث يتواجد فيلم أكسيد الألومنيوم والضغط بلطف لدفع الإطار والسطح ضد بعضها البعض لجعلها تلتزم.
ملء غرفة المراقبة فورا مع الكالسيوم HEPES العازلة. لا تملأ حجم الغرفة بأكمله للسماح بإضافة الدهون المُعاد تهيؤها في الخطوة اللاحقة. ضع الغرفة على مرحلة المجهر confocal.
نقل المواد الدهنية rehydrated، والآن تعليق تحتوي على vesicles العملاقة، إلى الغرفة مع ماصة المراعي البلاستيكية. انتظر 10 إلى 20 دقيقة للسماح للحرفيات التمسك الركيزة وتنتشر عبر السطح. يبدأ الانتشار مباشرة بعد ترسب الدهون على السطح.
قبل أن ينتشر الدهون هيكل تبادل العازلة يجب أن يتم بلطف ممكن إزالة سريعة أو إضافة سريعة من الاضطرابات العازلة هياكل الدهون على السطح. بعد مراقبة ينتشر الدهون متعددة، وإزالة ببطء المخزن المؤقت المحيط عن طريق ماصات التلقائي. مثل هذا أن يبقى فقط فيلم عازلة رقيقة على الجزء السفلي.
الحرص على تجنب الإزالة السريعة. انتقل إلى تبادل المخزن المؤقت المحيط بملء غرفة المراقبة ببطء بمخزن chelator HEPES باستخدام ماصة تلقائية. تجنب الإضافة المفاجئة.
الخطوة النهائية تسفر عن شبكات نانوية ديناميكية شكلت نتيجة للتخلص من الدبابيس المستحثة و التراجع من DLBM إلى vesicles متعدد البرام. تظهر هنا صور صغيرة لشبكات الأنابيب النانوية التي تم الحصول عليها في البروتوكول. في هذه الصورة، المناطق الحمراء الساطعة المستمرة هي الجزء المتراجع من DLBM، الذي تم وضع علامة عليه بخط أزرق متقطع.
يظهر هنا، هو micrograph من شبكة أنبوبي التي تم عكسها لزيادة التباين. هنا ، يتم إظهار انخفاض الكثافة الأنبوبية على منطقة الغشاء على مدار ثلاث ساعات و 20 دقيقة. يحدث انخفاض الكثافة الأنبوبية بسبب إزالة الدبابيس التدريجية التي يتبعها تراجع DLBM من السطح.
ويمكن تحديد مواقع نقاط التثبيت بوساطة الكالسيوم باعتبارها النقاط التي يكون فيها الأنبوب محطة أو المنعطفات الحادة. ويشار إلى المنعطفات الحادة كـ V تقاطعات أو نقاط تحول بسبب التحول المفاجئ في اتجاه محاذاة الأنابيب. نقطة النهاية يمثل نهاية الأنبوب الذي يمنع أنبوب من التراجع.
إذا استمر الانتشار لفترات طويلة ، يزداد التوتر الغشاء مما يؤدي إلى تمزقات. منذ التسمية الفلورية الدهون fluorescently، ويمكن أن يلاحظ مباشرة تمزق. ومن المؤشرات الرئيسية للتمزق الانخفاض الكبير في شدة الفلورنس في المنطقة الممزقة.
الجفاف الكامل للعينة أو التبادل السريع للمخازن يسبب اضطرابًا أو تمزقًا أو تشوهًا للبقع. يمكن بناء تعقيد النموذج عن طريق إضافة المكونات المرتبطة ER مثل بروتينات الدهون. ويمكن أيضا أن يكون هذا النموذج ضمني لدراسة التجميع الذاتي، نانولويدييكس، تدفق المارانغوني، وظواهر النقل.
الكلوروفورم هو سام ومتقلب للغاية وينبغي دائما أن تعامل تحت غطاء محرك الدخان ومع المعدات الواقية الشخصية المرتبطة بما في ذلك قفازات مختبر خلات البولي فينيل، ومعطف المختبر، ونظارات السلامة.
