Aquí, demostramos un procedimiento relativamente simple y directo para ensamblar redes de actomiosina atadas a membrana y estudiar la dinámica utilizando técnicas microscópicas de luz avanzadas. La ventaja clave es que nuestro ensayo permite la adición secuencial de proteínas y moléculas pequeñas sin perturbar las redes atadas a la membrana. Este método se puede adaptar fácilmente para estudiar otras proteínas citoesqueléticas o redes compuestas.
La parte más crítica del protocolo es garantizar que la bicapa lipídica soportada se forme correctamente, por lo que primero, tuvimos que dominar este paso antes de comenzar a agregar las proteínas citoesqueléticas. Para comenzar, tome de tres a cinco cubreobjetos de vidrio rectangulares y colóquelos dentro de un frasco de coplin. Encienda el sonicador de baño y ajuste la temperatura a 65 grados centígrados.
Llene el frasco de coplin con una solución de limpieza al 2% para sumergir completamente los cubreobjetos y colóquelo en el sonicador durante 30 minutos en modo de pulso completo. Use pinzas recubiertas de PTFE romo para quitar los cubreobjetos uno por uno. Enjuáguelos bien con agua destilada y colóquelos en otro frasco de coplin lleno de dos hidróxido de sodio normales.
Sonica los cubreobjetos durante 20 minutos en modo de pulso completo. Retire los cubreobjetos, enjuague bien con agua destilada y colóquelos en otro frasco de coplin lleno de agua destilada. Antes de comenzar el experimento, tome el frasco en una campana química equipada con un suministro de gas nitrógeno.
Use guantes y pinzas para quitar los cubreobjetos y secarlos bajo la corriente de nitrógeno. Seque ambos lados y colóquelos en una rejilla de plástico limpia con una cubierta. Coloque la caja con los cubreobjetos en un desecador para evitar el contacto con partículas de polvo, luego tome tubos de PCR esterilizados en autoclave y corte sus tapas y mitades cónicas inferiores con una cuchilla quirúrgica afilada.
Tome los tubos cilíndricos de medio corte, aplique adhesivo curable UV en el borde liso de cada tubo cortado y colóquelo invertido en un cubreobjetos recién limpiado de modo que el borde quede plano sobre el cubreobjetos. No mueva el cilindro lateralmente una vez que esté colocado en el cubreobjetos para asegurarse de que el pegamento no se derrame en el espacio central de la cámara. Coloque los cubreobjetos del cojinete de la cámara dentro de un limpiador de ozono UV con suministro de oxígeno y vacío.
Encienda la luz UV e ilumine durante tres a cinco minutos para permitir que el adhesivo polimerice. Saque los cubreobjetos y pruebe las cámaras para detectar fugas, y deseche las cámaras con fugas. Lave cada cámara con tampón de formación SLB, dejando 100 microlitros de tampón al final.
Marque el nivel del tampón a 100 microlitros con un marcador permanente, luego agregue dos microlitros de cloruro de calcio molar 0.1 a la cámara, seguido de ocho microlitros de la solución SUV a cada cámara e incube durante 15 minutos a 25 grados centígrados. Retire 50 microlitros del tampón de formación SLB, dejando solo 50 microlitros en la cámara de muestra, luego agregue 100 microlitros de un XKMEH a la cámara y mezcle suavemente. Retire 100 microlitros del tampón sin tocar el fondo.
Repita los lavados de ocho a 10 veces agregando 100 microlitros de un XKMEH y retirando 100 microlitros. Agregue 10 microlitros de un miligramo por mililitro de beta-caseína a la bicapa, mezcle suavemente e incube durante cinco a 10 minutos a temperatura ambiente. Lave la beta-caseína tres veces con un XKMEH y vuelva a llevar el nivel de tampón a la marca de 100 microlitros.
Durante la incubación de beta-caseína, saque una alícuota de proteína enlazadora de actina de membrana por menos 80 grados centígrados descongelada rápidamente a 37 grados centígrados, y luego manténgala en hielo. Diluir la alícuota con tampón de dilución de proteínas hasta una concentración de un micromolar. Agregue la proteína enlazadora a la solución a una concentración final definida y mezcle suavemente.
Incubar durante 30 a 40 minutos a temperatura ambiente y lavar de tres a cinco veces con un tampón XKMEH para eliminar la proteína HSE no unida. Lleve el nivel de amortiguación en cada cámara a la marca de 100 microlitros. El ejemplo ya está listo para la creación de imágenes.
Encienda el microscopio, los láseres de excitación y las cámaras de detección. Asegúrese de que el láser esté alineado, que el objetivo se limpie y que el software esté listo para adquirir imágenes. Ponga aceite en el objetivo de 100 veces, monte la muestra en la etapa del microscopio y enfoque el objetivo en la bicapa.
Asegúrese de que la posición del láser sea tal que sufra una reflexión interna total en la muestra. Utilice una excitación de 488 nanómetros. Para determinar la integridad de la bicapa, realice un ensayo FRAP rápido seleccionando una región de interés en la bicapa y registrando algunas imágenes del campo de visión utilizando condiciones de imagen que proporcionen una relación señal/ruido de cinco a uno o más.
Pause la grabación y cierre el diafragma de campo del microscopio TIRF para enfocar un rayo láser concentrado en una pequeña región circular de la bicapa para blanquear localmente los fluoróforos. Encienda el láser a su salida máxima para fotoblanquear la pequeña región durante tres a 10 segundos, y luego apague el láser. Vuelva a abrir el diafragma de campo a su radio original, reaajuste la condición de imagen a la configuración previa al blanqueador y reanude inmediatamente la grabación de la recuperación de la señal fluorescente en el campo de visión.
Compruebe si la bicapa es fluida y guarde las imágenes como archivos TIF de punto de 16 bits. Mezcle la actina G no marcada y marcada con fluorescencia en una proporción molar de 10 a uno, y rellénela con tampón G para que la concentración de actina G sea de 20 micromolares. Agregue una décima parte de 10 veces el tampón ME a la mezcla para obtener una solución única e incube durante dos minutos a temperatura ambiente.
A continuación, descongele el vial de tapado de proteínas rápidamente a 37 grados centígrados, y luego manténgalo en hielo. Diluir con tampones G de tal manera que la concentración de proteína de tapado ahora sea el doble de su concentración final deseada, luego agregue un volumen igual de la solución de proteína de taponado diluida a la mezcla de actina. Finalmente, agregue un volumen igual de tampón objetivo fresco dos veces a la mezcla de reacción.
El volumen final de la solución debe ser cuatro veces el volumen de la mezcla de actina. Asegúrese de que la concentración final de los componentes sea como se describe en el texto manuscrito. Incubar las muestras en la oscuridad a 25 grados centígrados durante 45 a 60 minutos para permitir la polimerización.
Pipetear suavemente cinco actina polimerizada micromolar con una punta de pipeta de extremo romo y agregarla a un tubo de PCR limpio en autoclave. Agregue un XKMEH al tubo para que el volumen final sea superior a 20 microlitros, y mezcle suavemente para evitar el cizallamiento de la actina F. De la cámara de muestra montada, retire un volumen igual del tampón.
Agregue la solución de actina polimerizada a la cámara y pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo tres veces sin tocar la bicapa en la parte inferior. Monte la muestra en el microscopio TIRF y déjela reposar durante 20 a 30 minutos. Grabe algunas imágenes de diferentes campos de visión después de que la adición de F-actina haya alcanzado un estado estable.
Después de 30 minutos de incubación de actina, vuelva a montar la muestra en el microscopio. Compruebe la señal en la proteína enlazadora y los canales de actina F. Ajuste las condiciones de imagen si es necesario.
Seleccione una buena región para una grabación de lapso de tiempo largo. Grabe de 10 a 15 fotogramas a 0,1 a 0,2 hercios antes de la adición de miosina y detenga la grabación. Pipetear el volumen requerido de miosina muscular reciclada dos del vial material con una punta de pipeta roma y añadirlo a un tubo de PCR en autoclave limpio.
Agregue inmediatamente un XKMEH al tubo para que el volumen sea superior a 20 microlitros y mezcle suavemente. Retire con cuidado un volumen igual del tampón KMEH de la cámara de muestras montada sin molestarla, y agregue suavemente la solución de miosina a la cámara de muestra. No pipetear hacia arriba y hacia abajo, ya que perturbará los filamentos unidos a la superficie.
Reanude inmediatamente la grabación de lapso de tiempo y guarde todas las imágenes, luego tome imágenes de fondo para todos los canales utilizando una muestra de solo búfer. Guarde todas las imágenes como archivos TIF. El valor ajustado del coeficiente de difusión fue de 1,34 micrómetros cuadrados por segundo, lo que concuerda estrechamente con el valor calculado basado en fórmulas de 1,39 micrómetros cuadrados por segundo.
El perfil de línea después del fotoblanqueo y el perfil de recuperación de la región blanqueada se ajustan a las ecuaciones cuatro y cinco, respectivamente. La fracción móvil de la bicapa lipídica que representa la fracción de la población blanqueada que se recupera fue mayor que 0,9, lo que indica una buena bicapa lipídica. La actividad de la miosina indujo flujos de actomiosina contráctil que emergieron en estructuras similares a los astros en el estado estacionario, impulsando la agrupación local del componente de membrana acoplada.
Se puede utilizar una variedad de técnicas de microscopía, como la microscopía de dispersión interferométrica para estudiar la dinámica de las redes de actomiosina no marcadas sin inducir ningún daño fotográfico, o utilizar la microscopía de fluorescencia de súper resolución. Esta técnica allana el camino para que los investigadores interesados en comprender cómo los complejos de proteínas de membrana interactúan con una red dinámica de actomiosina modulen su arquitectura y composición.
